周二文献分享时间又来啦~今天小编跟大家分享一下《宏基因组测序揭示深古菌门中的 代谢》文献，一起来学学哦~~~
不同的靶基因扩增子在真菌多样性研究中的比较
Differentamplicontargetsforsequencing-basedstudiesoffungaldiversity
杂志：appliedandenvironmentalmicrobiology时间：年6月 IF:3.
研究背景1、真菌在许多不同的环境中是非常重要的，为了解决微生物生态学中的基本生物学问题，对其结构进行准确和详细的描述是必须的；
2、基于高通量测序技术的环境样品分析，可以直接得到微生物种类的丰度信息，克服了基于培养所施加的限制，然而，由于实验方法和生物信息分析也引入了偏差；
3、丰富的公共数据库使得使用分类学相关基因测序研究不同环境中微生物群落的组成变得越来越方便；
4、ITS1-2广泛用于真菌群落分析，然而，ITS1-2的长度在不同属和种的真菌之间是多变的，因此从环境DNA中扩增该基因会存在优先扩增并对物种丰度的评估产生偏差。
研究方法1、引物选择与评估：作者挑选了用于扩增18SrRNA基因V4区、26SrRNA基因D1/D2区以及ITS1-2的三对引物，并通过过滤一些模糊的数据，只保留注释为真菌的序列且涵盖所有真菌系谱的数据库，用于评估引物的特异性和分类学上的覆盖度；
2、挑选已经测序过整个ITS区域的真菌进行分离培养和DNA提取；
3、DNA提取后，为了评估共同扩增偏好（co-amplificationbiases）带来的影响并确保使用的引物能够检测所有包含的物种，采用了下图中两种不同的方案进行扩增建库；
4、用已知的19个真菌构建模拟群落，并进行建库测序分析；
5、收集包括土壤、人类唾液、人类粪便和葡萄汁等真实的生物样品用于比较分析。
研究设计的示意图
研究结果1、引物评估：
1）18S扩增子引物错配数量较少，ITS1的上游引物错配率 ；
2）所有的引物均显示了对真菌有广泛的覆盖度，其中18S扩增子引物的分类学覆盖度更高，ITS1上游引物分类学覆盖度 。
2、模拟真菌群落分析
1）Mock-Ampl样品在真菌区系组成上没有显著差异（P0.05），所有靶基因扩增子都能够检测到19种所使用的已知的真菌。
2）所使用的菌株ITS1-2长度约在bp至bp之间。有趣的是，Mock-DNA样品中，使用ITS扩增子，ITS1-2长度在约bp和bp的的酵母菌株M.pulcherrima和P.kluyveri的丰度表现得过高；而ITS1-2约bpZygosacharomycesbailii和Hanseniasporanguillermondii丰度明显被低估。
3）不论使用何种靶基因扩增子，Mock-Ampl样品均显示出与理论上相似的群落组成。多元方差分析检测到Mock-DNA样品中不同靶基因扩增子之间，真菌群落的总体组成存在差异。
4）与其它靶基因扩增子相比，26S和18S之间的平均Bray-Curtis距离较低，而ITS得到差异 的结果。
5）PCA分析显示：Mock-DNA样品中不同的靶基因有明显单独的聚类；而Mock-Ampl样品，不管使用什么靶基因扩增子，都聚在一起。但是，所选择的靶基因似乎没有影响α-多样性指数。
用三种不同靶基因扩增子在模拟群落中鉴定的真菌种类的相对丰度。期望丰度（理论值）显示在最左边。结果为2个（Mock-Ampl）或4个（Mock-DNA）重复的平均丰度。
基于种水平的微生物群落主成分分析
6）在Mock-DNA样品中，模拟群落中的一些物种未被鉴定到，或者低于预期的丰度。下表是Mock-DNA样品中，通过三个不同靶基因扩增子分析显示出具有显著差异的种。Metschnikowiapulcherrima在26SrRNA和ITS测序分析中被高估，而Candidazeylanoides和Pichiaanomala在三个靶基因扩增子分析中都被低估。此外，Candidazemplinina仅在26SrRNA测序分析中被检测到。
3、真实生物样本中的真菌分析
作者收集了包括土壤、人类唾液、人类粪便和葡萄汁的真实生物样品，用于比较分析。用与模拟群落分析相同的方案来分析这些生物样品。结果显示，26SrRNA测序分析得到较高的α多样性（P0.05）。此外，不同的扩增子之间，作者观察到真菌群落组成的具有显著差异。如26SrRNA测序分析显示Sporobolomyces（Basidiomycota）在土壤样品中占优势，而在其它扩增子测序分析中却没有。Hanseniaspora在ITS测序分析中被低估。
用三种不同靶基因扩增子分析的生物样品中真菌在种水平的相对丰度
研究结论1、使用18SrRNA基因V4区、26SrRNA基因D1/D2区以及ITS1-2的三对引物都可以准确分析出存在的物种；
2、ITS1-2长度存在高度不均一性，这导致了具有较短ITS的物种丰度被过高估计，而18S和26S扩增子可以得到更可靠的结果；
3、在研究分析中，应仔细考虑ITS1-2测序的结果，可以针对不同靶基因和相关数据库尝试发现更好的可用引物，以促进扩增子分析在高通量测序分析中有效和可靠的应用。
实验部林爱强文案
潘旭兰编辑
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