如何利用数字PCR来验证基因组编辑的结果

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长久以来公认DNA聚合酶不能仅以核苷酸底物从头合成DNA,必须要在一段特定长度的DNA或RNA引物末端开始聚合DNA。而来自华中科技大学,哈佛大学,日本地球海洋科技局的研究人员近期发现了自然界已知的第一个不需要引物的DNA聚合酶,这不仅在聚合酶进化研究中有重要意义,而且还蕴藏了在核酸合成和测序技术中的应用价值。

图1:数字PCR检测NHEJ诱导突变的示意图。A)双重引物探针检测。B)drop-off探针和参考探针通道中荧光的2D图像。图片来自Addgene。

在CRISPR基因组编辑之后,工作并没有结束,你需要验证感兴趣的基因是否成功突变。目前有几种方法可供选择。新一代测序技术当然是金标准,但对于许多实验室而言仍然是高不可攀的,对于小型项目来说也是不切实际的。为此,加拿大阿尔伯塔大学的ScottFindlay引入数字PCR,作为新兴的验证技术。

数字PCR(dPCR)的原理相信大家都有所了解。它将样品分为成千上万个液滴,使得大多数液滴只包含一个目标DNA拷贝,或没有拷贝,之后利用PCR扩增目标。它不像实时定量PCR那样跟踪反应进程,而是在反应结束后评估每个液滴的阳性或阴性信号。通过统计建模可确定原始样品中目标DNA分子的实际数量。这意味着数字PCR可以对目标丰度进行绝对定量,而不需要标准曲线。

突变筛选

之后,Findlay介绍了如何利用数字PCR来进行突变筛选。其实,这与平常的实时定量PCR中的引物探针检测并没有太大的差异。这些分析可检测通过同源定向修复(HDR)整合的供体序列,或通过非同源末端连接(NHEJ)产生的插入缺失突变,具体取决于你的基因组编辑。

由于NHEJ的采用可产生改变翻译阅读框的插入缺失,将感兴趣基因的功能敲除,已成为基因组编辑最常见的应用之一,故Findlay详细介绍了NHEJ的检测(图1)。这些检测包括扩增目标位点的正向引物和反向引物,与未编辑位点结合的参考探针(离预测的双链断裂较远),以及直接与双链断裂位点结合的drop-off探针。

数字PCR具有单分子分辨率,因此可根据突变状态对单个目标分子进行分类。drop-off探针与野生型的序列完美匹配,故不能检测突变目标。每个样品中突变型和野生型目标的数量可快速计算,这样就能量化基因组DNA样品的突变率。

数字PCR的优势

与人们常用的错配核酸酶检测相比,数字PCR检测具有几个明显优点。

灵敏度:不到20ng的gDNA已足够用于分析。研究人员通常采用96孔板单个孔中的几千个细胞进行分析,而无需预先定量。相比之下,错配检测需要-ng的纯化PCR产物。

检测限低:数字PCR可准确定量高背景下低水平的突变目标(低至20pg或0.02%)。而错配核酸酶检测的检测限大约是5%的突变目标。

区分单等位基因和双等位基因突变的能力:数字PCR最突出的优点就是,在筛选目的基因的功能被完全敲除的克隆时,它们能够轻松地区分单等位基因和双等位基因突变。错配核酸酶检测在这一重要差异上则完全是“瞎”的。

现在,你也可以试试用数字PCR来验证你的基因组编辑。不过要记住,后续仍然需要DNA测序来确认突变的确切性质。最后说一句,祝你好运!




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