因rAAV载体基因盒包装容量的限制，rAAV所表达的转基因大小只限于4.5–4.6kb（不包括两个ITRs)。因此运载大片段基因一直是rAAV载体面临的一个挑战。通过截短内含子和外显子可以适当的增加包装尺寸。因此，许多rAAV基因盒中的大型cDNAs不包含或只包含少量的原生内含子(见表1)。然而内含子有很多功能，如增加mRNA的稳定性、调节RNA合成速率、引入可变剪接、减少因高表达导致的DNA损伤等。
此外，内含子可以指令mRNA从细胞核向内质网的输出机制。去除rAAV基因盒中的内含子可能会进一步改变其内在的基因调控。以CRB1蛋白为例(UniProtKBP-1)，由个氨基酸组成，有,bp碱基编码。单独外显子为bp，包括3终止密码子，其大小接近rAAV的最大包装容量。利用短启动子(bp)和合成的聚腺苷酸化序列（50bp），也可以实现CRB1在视网膜细胞中的高效表达。
表1：已经在clinicaltrails.gov上注册的rAAV基因治疗产品
通常情况下不建议截短蛋白(截短的外显子又名minigenes)，因为许多截短的蛋白有可能失去功能。例如，许多截短的杜氏肌营养不良基因(DMD;2.3Mb;79-exons;aminoacids;11,bp)并不能救治肌肉细胞中的杜氏肌营养不良表型，但有报道说对于micro-dystrophin（较温和的临床表型）有效果。
但是从临床试验结果看，截短的蛋白的治疗效果目前只能算处于退而求其次的状态，还需要进一步优化。研究人员尝试了天然的短CRB1蛋白（CRB1cDNA缺失exons3/4,但是保持开放阅读框）。
让人失望的是，视网膜下注入AAV9-CMV-sCRB1或AAV9-hGRK1-sCRB1sCRB1后，虽然可以表达，但是却引起视网膜退化。
另一个例子是CEP基因(7.5kbcDNA、个氨基酸)因为太大而无法放入rAAV载体中。截短版的CEPcDNA(CEP580-编码RAB8A结合域)可以暂时救治Ceprd16小鼠的部分纤毛长度和视网膜功能。
Ophthotech(现在的Iveric)开发了用于rAAV载体治疗miniCEP580–（尚无公开信息）、miniABCA4、（尚无公开信息）和miniUSH2A（尚无公开信息）。
USH2A基因(15.6kbcDNA、个氨基酸)截短为miniUSH2A-1(~6.8kb)和miniUSH2A-2(~4.1kb)，并通过Tol2转座酶mRNA传递到纯合的单细胞阶段ush2armc1斑马鱼胚胎中，可以恢复视觉运动反应和视网膜功能。
应用替代蛋白除了缩短的蛋白，替代蛋白也是一种方案，如utrophin来替代dystrophin。研究人员开发了用Crumbshomolog2gene(CRB2;3.8kb)治疗CRB1-相关的视网膜营养不良的替代基因疗法。然而，这种策略的前提是替代者与被替代者在细胞中执行类似的生物学功能，比如CRB1和CRB2。rAAV-CMV-CRB2救治小鼠Müller胶质细胞CRB1功能的丧失。有趣的是，缺失CRB1的小鼠或缺失CRB2的小鼠视网膜所出现的表征与人类ipsc来源的缺失CRB1的视网膜器官相同。另外替代蛋白可能比天然蛋白的免疫原性更低，例如utrophin要胜过dystrophin，因为替代蛋白是体内已经表达了的蛋白。替代蛋白在许多rAAV基因治疗中具有很大的潜力。调节信号通路中的重要因子识别信号通路中的关键因子(如VEGF、TGF-β、Wnt)是一个令人振奋的同时也是个复杂的研究领域。以青光眼治疗为例，可以通过改变一个关键因子的表达(例如，通过抗体或病毒载体给药)从而引起眼内压(IOP)的持续变化。
对于关键因子的检索一般可以从以下几方面着手：(a)青光眼患者中常见的突变基因(singlenucleotidepolymorphisms[SNP]databases例如，CAV-1)。(b)受青光眼影响的基因([single-cell]RNAseqhealthy-diseaseconditiondatabases例如：ANGPTL7、MMP1和PLAT)。(c)参与调节眼压的基因产物（例如，来自基因库筛选以及文献检索的基因敲除数据、例如RhoA-Rho激酶和前列腺素EP4激动剂）。RP和LCA通路基因的鉴定也在探索类似的方法。通路修饰因子的表达可通过注射释放生长因子的神经祖细胞（jCyte,Inc,产品jCell、ReNeuronLimited，产品hRPCRP)，或表达特定关键因子的病毒载体(见图1，表1rAAV产品用于AMD/青光眼)。细胞存活因子，如色素内皮生长因子(PEDF)已在3.3节讲述（见上期综述第二部分）。例如，通过反复玻璃体内注射抗体抑制血管内皮生长因子受体(VEGFR)的激活以及RPE和脉络膜中补体的级联激活已成功应用于临床研究。这促使了一类rAAV基因盒的开发，该基因盒在感染后可以表达一种可溶性蛋白片段，并可以部分与VEGF受体或补体系统蛋白结合从而抑制了疾病通路的级联反应。
这些载体在AMD模型中有效地抑制了AMD表征的全面爆发，目前正在临床试验中进行测试的载体有：
(1)小的可溶性fms-like酪氨酸激酶-1(sFlt-1，FLT1基因编码的的非膜结合的VEGFR1的剪接变体，AdverumBiotechnologies;SanofiGenzyme)；
(2)内皮抑制素(XVIII胶原的裂解产物)/血管抑制素(纤维蛋白原的裂解产物，OxfordBiomedica)；
(3)补体因子I(CFI，补体级联中的C3b/C4b灭活剂，GyroscopeTherapeutics)；
(4)anti-VEGFfab重链和anti-VEGFfab轻链(Regenxbio)；
(5)可溶性CD59抗原(与C5b结合，阻止C9在补体级联中介入;HemeraBiosciences)。
图一：视网膜基因治疗策略概述
光激活的opsin-like蛋白最后，研究人员在探寻光激活的opsin-like蛋白的表达，以恢复RP患者(部分)视力(见表1rAAV产品RST-、GS和BSO1)（见综述上部）。临床试验研究了三种不同的荧光蛋白，分别为：
ChR2又名Channelrhodopsin-2
ChR88m19-tdTomato
Chr90又名Chronos
Chronos-GFP(green-shifted)和ChrimsonR-tdTomato(red-shifted)是第二代荧光蛋白，与ChR2相比具有更快的动力学和更强的光敏感性。
目前需要进一步的研究来找出以下哪些方法可以恢复眼部疾病患者的最佳视觉:
(1)野生型或替代的基因（例如,CRB1-RP病人应用CRB1或CRB2）；
(2)截短基因补充(例如,miniCEP580–)；
(3)神经保护因子(例如,CNTF)；
(4)抗血管新生因子(例如,sFLT1)；
(5)疾病通路的调节(例如,ANGPTL7（青光眼）)；
(6)引入光活性蛋白。
上篇原文解读(1)AAV载体在眼部基因治疗临床试验的应用（上）
(2)解读
AAV载体在眼部基因治疗临床试验的应用（中）
原文请参阅：ThiloM.BuckandJanWijnholdsRe