小麦持久多抗基因Lr34Yr18Sr57

1.Lr34基因的图位克隆

Krattinger等()利用精细定位群体进一步缩小了Lr34位点的范围，将其定位在分子标记XSWSNP3/XcsLVA1和XcsLVE17之间，遗传区间大小为0.15cM。随后，他们测通了两侧标记所在kb的中国春基因组DNA，预测到8个基因，综合基因结构完整性、材料表型、等位基因序列和遗传分析等信息，将ABC转运蛋白(ATP-bindingcassettetransporter)基因锁定为唯一候选基因。同时，还对8个独立的感病突变体进行测序分析，发现每个突变体中的ABC转运基因都发生了变异，而且这些突变体对叶锈病、条锈病和白粉病都表现为感病，并丧失了叶尖坏死特征(图1)。由此推测这个ABC转运基因就是控制多病害抗性和叶尖坏死的Lr34基因。

图1Lr34基因的图位克隆(Krattingeretal.,)

Lr34基因全长bp，由24个外显子和23个内含子组成，编码含有个氨基酸残基的ABC转运蛋白，属于多效耐药性蛋白亚家族，具有2个保守的胞内核苷酸结合结构域和2个疏水性跨膜结构域。在已报道的基因中，拟南芥PEN3/PDR8也是ABC转运蛋白基因，能提供对大麦白粉菌的非寄主抗性。作者进而比较了Lr34基因在抗病小麦品种中国春(Lr34+)和感病小麦品种Renan(Lr34-)之间的序列差异，发现两者在启动子区并没有差异，但在基因内部存在3个差异位点：第1个为SNP，位于第4个内含子；第2个为位于第11个外显子的3-bp缺失(TTC)，导致编码蛋白中第位苯丙氨酸残基(F)的缺失；第3个为SNP，位于第12个外显子，导致编码的氨基酸残基由酪氨酸变为组氨酸(YH)。因此，与感病等位基因Lr34sus的编码蛋白相比，Lr34(Lr34res)编码产物仅存在两个位点的差异。RT-PCR分析表明，Lr34基因抗、感小麦中的表达水平没有差异，但在发育14天(20°C)的抗病小麦幼苗中表达水平很低，在53天和63天(此时已表现出叶尖坏死症状)的成株旗叶中表达水平显著增高，从而解释了Lr34为何表现为成株抗性。

2.Lr34基因具有禾本科作物多病害抗性

尽管在图位克隆Lr34基因时没有提供转基因证据，但Keller课题组和澳大利亚CSIRO的Lagudah课题组在后来的研究中将该基因转入小麦、大麦、水稻、玉米和高粱等作物(Risketal.,;Risketal.,;Krattingeretal.,;Sucheretal.,;Schnippenkoetteretal.,;Bonietal.,)，发现该基因能提高这些作物对多种(半)活体寄生真菌病害的抗性，如大麦的叶锈病和白粉病、水稻的稻瘟病、玉米的锈病和大斑病、高粱的锈病和炭疽病等。这些研究表明，Lr34基因不仅能提高小麦对多种真菌病害的抗性，也能提供大麦、水稻、玉米、高粱等禾本科作物对多种真菌病害的抗性，在这些禾本科农作物的生产上具有极为重要的应用价值。

尽管与Lr34基因伴生的叶尖坏死症状只发生在成株期的旗叶上，但对作物产量也产生了显著的不利影响。据一项调查显示，Lr34基因叶尖坏死性状的表达会导致小麦减产5.9%(SinghHuerta-Espino)。转基因研究发现，抗病性提高的各物种转基因材料在成株期也多表现出叶尖坏死症状，甚至有些转基因株系中的Lr34基因表达水平过高，在苗期就开始出现叶尖坏死，严重降低植株长势、分蘖数、小穗数和谷物产量(Risketal.,；Krattingeretal.,)。Rinaldo等()将Lr34基因转入硬粒小麦，发现转基因植株在苗期就对小麦叶锈病、条锈病和白粉病表现良好抗性，但是Lr34表达水平较低，并不在苗期出现叶尖坏死。由此推测，叶尖坏死或衰老并不是Lr34抗性的必要条件。这预示着严格控制Lr34基因的表达水平，不仅能实现苗期抗性，也能消除叶尖坏死。Boni等()将Lr34基因构建到病原诱导型启动子Hv-Ger4c下游，然后转入大麦品种GoldenPromise，获得16个独立的转基因株系，高抗大麦叶锈病和白粉病。随后在温室和类似田间条件下对一个转基因株系进行农艺分析，发现转基因株系的谷物产量与野生型大麦相似，并无显著的不利影响(图2)，在育种上具有潜在应用价值。

图2病原诱导型启动子控制的Lr34转基因大麦(Bonietal.,)

3.Lr34基因的抗性机理

Lr34基因能在多个物种中都发挥抗病功能，说明它涉及保守的抗病分子机理，因此，揭示其抗性机理具有重要意义。与常规抗病基因介导的抗性不同的是，Lr34抗性不涉及过敏反应(HR)和胼胝质沉积，也不涉及防卫蛋白(PR)基因的上调表达(Risketal.,)。在含有抗病等位基因Lr34a的品种中，苗期叶片中只有35%的转录本具有正确的拼接方式，大部分的转录本(65%)由于错误的拼接形成了不正确的剪切体；在成株期Lr34a基因发挥抗病功能的叶片中，也检测到了Lr34a基因转录本的错误拼接。这些错误的剪切体会导致读码框提前终止，产生不完整的抗病蛋白。这些结果暗示着Lr34基因的部分抗性可能与其较大比例的错误剪接体相关(Fangetal.，图3)。

Krattinger等()利用Lr34转基因水稻进行转录组分析，发现了个与Lr34抗性相关的核心基因，包括个基因上调表达，13个基因下调表达，其中许多基因都受生物胁迫和非生物胁迫的诱导，并与脱落酸(ABA)诱导相关。作者随后着重调查了ABA调控的性状，发现Lr34转基因株系8和19的叶片蒸腾率和气孔导度减少，从而耐旱性显著提高；转基因株系16和19对外源ABA的敏感性提高，在含5μMABA的培养基中其根长减少了50%(图4)。然后又利用放射性3H-ABA进行检测，结果显示，在处理10分钟后，转基因株系11和19幼苗的ABA积累水平显著高于对照。

图4Lr34转基因植株ABA相关性状(Krattingeretal.,)

Krattinger等()将Lr34res(Lr34a)、Lr34sus(Lr34b)和空载体分别导入突变型酵母菌株YMM12(该菌株的8个ABC转运蛋白基因都存在缺陷)和野生型酵母菌株W。结果表明，LR34res和LR34sus都能够提高两种酵母菌株对放射性3H-ABA的吸收，而ABC转运蛋白抑制剂格列本脲(glibenclamide)可以阻断LR34对3H-ABA的吸收，此外，添加非放射性ABA可竞争性地较少LR34对3H-ABA的吸收(图5)。由此可见，LR34res和LR34sus都能在酵母中吸收ABA，但是，只有LR34res能在植物中改变ABA水平。综上，Lr34基因编码的ABC转运蛋白是作为ABA转运蛋白参与了植物抗病性。另外，对转基因大麦中带HA标签的LR34res和LR34sus进行Western杂交，可以检测到LR34res，但检测不到LR34sus，这表明Lr34res和Lr34sus在植物体内可能还存在转录后调控或翻译后调控的差异。

图5LR34参与ABA转运(Krattingeretal.,)

4.Lr34基因的多样性与起源

目前已经发现Lr34基因在小麦品种中存在Lr34a-Lr34g多个等位变异。中国春中的抗病Lr34等位基因被称为Lr34a，Lr34a是由感病品种Renan中的祖先感病位点Lr34b通过自然变异获得抗病功能，小麦品种Billings中的感病位点为Lr34c。检测和分析更多的种质资源，Lagudahetal.(,)和Caoetal.()发现感病小麦品种Jagger中的Lr34基因在第22个外显子上存在一个G/T点突变，产生了终止密码TGA，导致编码的蛋白提前终止，缺少了C末端个氨基酸(图6)。之后将Jagger中的Lr34等位基因命名为Lr34d，将另一个小麦品种中的抗病等位基因命名为Lr34e。最近，Fang等()发现美国小麦品种Duster(PI)的7D染色体上存在包含有Lr34在内的3个基因区段重复，形成两个紧密连锁的Lr34拷贝，其中一个是抗病的Lr34a，另一个是感病的Lr34b(图6)，但目前发生重复的原因还未知。

Krattinger等()以中国春及缺体-四体为材料，利用Lr34基因为探针进行Southern杂交，检测到Lr34基因的三个直系同源基因Lr34-A、Lr34-B和Lr34-D(Lr34)，分别位于7A、4A(4A和7B染色体存在易位)和7D染色体(图7)。

图7Lr34直系同源基因在中国春缺体-四体中的Southern结果(Krattingeretal.,)

图8Lr34直系同源基因在不同亚基因组中的基因结构(Krattingeretal.,)

Krattinger等()检测了远东、南美、北美和欧洲的小麦种质，发现Lr34基因在这些地区的小麦资源中均有分布。年又检测了77份小麦地方品种，包括66个中国小麦地方品种，发现50%中国小麦地方品种都含有Lr34基因(Krattingeretal.,)(表1)。

表1Lr34基因在各国小麦品种中的分布(Krattingeretal.,)

图9Lr34基因单倍型分析(Dakourietal.,)

Krattinger等()研究了Lr34同源基因在禾本科植物中的分布，结果表明Lr34同源基因出现在水稻、高粱等基因组中，但在大麦、玉米和短柄草中都没有发现同源基因(图10)。进而详细分析了32份水稻、97份高粱和份节节麦的Lr34同源基因序列，都没有发现抗病单倍型的特有变异。该结果表明，Lr34基因的功能获得性突变发生在小麦物种形成之后，不同小麦品种携带的Lr34基因有着共同起源(Krattingeretal.,)。

图10Lr34同源基因的物种分布(Krattingeretal.,)

5.Lr34/Yr18/Sr57/Pm38/Sb1/Ltn1基因的育种应用

参考文献

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