MixClone?是一项取代RNA干扰的“细胞快速基因敲除”技术。该技术优化每一株细胞的参数，极大的简化了基因编辑流程，周期短至四周，基因编辑效率可以高达80-95%，成本只有RNA干扰的一半，可直接用于下游基因功能分析；全新的生物信息算法，可以大幅提升数据的准确度。
MixClone?技术的流程
MixClone?技术可用于快速构建原代细胞、干细胞等传代有限和难以形成克隆的困难细胞的基因敲除研究。可用于大规模的基因功能筛选、基因功能缺失性研究、药物靶点发现、药物靶点验证、基因敲除细胞的体外成瘤性研究以及基因通路相关的细胞信号转导、代谢、增殖、迁移能力等研究。
MixClone?技术在不同细胞系上的敲除效率
（AAVS1位点是人类基因PPP1R12Cintron1上的一段序列，是外源基因插入的safeharbor。）
与RNA干扰相比，MixClone?技术具有更显著的敲除效果
RNA干扰主要是利用小RNA与mRNA结合，导致靶标mRNA的降解，因而能暂时性地敲低（knockdown）基因的表达水平，敲低水平70%。由于RNA干扰靶向的是每个mRNA的转录产物，因此并不能导致目的蛋白的完全丢失（无法消除背景）。
MixClone?技术是基于CRISPR/Cas9系统产生的DNA层面稳定性的基因敲除，因而其功能缺失检测数据更为可靠稳定，是新一代的基因功能研究工具。
同时MixClone?技术比RNAi的脱靶率更低。
RNA干扰和CRISPR技术的on-target（横坐标）和off-target（纵坐标）的相对强度比较
右图：CRISPR技术on-target的平均相对强度为0.，off-target的平均相对强度为0.，97.4%的sgRNA其on-target的效率要高于off-target的效率（对角线以下的点）。左图：RNA干扰技术on-target的平均相对强度为0.，与CRISPR的效率接近；然而其off-target的平均相对强度为0.，远高于CRISPR，且只有41.8%的shRNA其on-target的效率高于off-target的效率（对角线以下的点）。总结：与RNA干扰相比，CRISPR技术具有更加高效的基因靶向性，同时脱靶风险更低。
MixClone?技术的创新基础：
Smart-Opti?平台：
我们需要提高每一种细胞的电转效率，找到高转染效率和高细胞存活率并存的条件。为此我们建立了针对每一种细胞的高通量、自动化的快速优化平台Smart-Opti?。只需要输入细胞系的名称，Smart-Opti?会从各大公开数据库中获取细胞的相关信息，并给出96个电转方案，按综合得分从高到低排列。同时系统会根据收集回来的白癜风判断安排多少组测试性价比 ，最多时可以一次性测试12个电转条件。细胞电转3天后，进行荧光信号检测，同步收集细胞存活率数据和荧光数据，匹配Smart-Opti?的自动分析系统，可瞬间获取 的电转参数组合。整个优化过程只需要3天。经过优化后的细胞转染效率平均提高25%。
不同电转参数，电转后细胞的存活率和阳性率差异很大
分子运输载体与电转技术：
任何的转染技术，外源DNA分子在进入细胞之前，必须实现2个关键过程，一是要使DNA尽可能接触到细胞膜，二是要诱导细胞膜发生可逆变化，使细胞膜瞬间开孔，使外源DNA分子通过细胞膜上的孔洞进入到细胞质中。基于这个技术原理，我们使用特殊分子材料粘附DNA分子，带有正电荷的DNA分子颗粒可以大量吸附到细胞膜表面。在电击作用下细胞膜瞬间开孔，DNA分子由此进入到细胞质中。并且可以有效防止DNA被细胞内的核酸酶快速降解，延长了DNA在细胞内的半衰期，并解决了DNA进入细胞核的障碍。因而大大提高了细胞的转染效率和基因编辑效率。
电转染技术运输DNA的过程：1.DNA粘附到细胞膜上；2.电击穿孔；3.包裹DNA的囊泡形成；4.DNA被运输到细胞内
CRISPR结构解离技术：
在sgRNA的引导下，Cas9蛋白对靶序列进行切割并产生DSB（双链断裂）。然而Cas9蛋白并不会立即从靶位点DSB上解离下来，反而会非常牢固的结合在靶位点上，其解离过程非常缓慢，会持续6-15小时。由于Cas9蛋白在靶位点DSB上的稳定结合，导致DSB躲过了基因组修复系统的监控，不能对双链断裂进行及时的修复（编辑）。这是影响基因编辑效率的一个重要因素。
a.Cas9蛋白在靶位点处产生双链断裂（DSB）并稳定结合在DSB上
b.体外条件下，Cas9蛋白和靶位点DNA结合的动力学分析：虚线左侧是分子间结合的速度；虚线右侧是分子复合物解离的速度
为此，我们在电转体系中引入一种Enhancer分子，可以促进非互补链的3’端序列从Cas9蛋白中游离出来，破坏Cas9-DSB结合的稳定性，并招募SSB蛋白（单链结合蛋白）等基因组修复因子，促进对双链断裂位点的修复，因而可以进一步提高基因编辑效率。
Cas9X?算法：智能算法准确计算基因编辑效率
经过Cas9编辑的混合细胞中存在多种基因型，其结果分析被认为是整个工作流程当中最为繁琐的环节。NGS测序是基因组编辑分析的金标准，但是成本高、耗时长。另一种更为常规的做法是，将混合细胞的PCR产物进行亚克隆，挑选几十到上百个单克隆进行测序分析，从中可以统计到混合细胞中所出现的基因型情况及其发生频率。但这项目工作耗时极长、工作量巨大。因此，找到一种快速廉价的结果分析方法是实现MixClone?技术的 一公里路。
由于混合细胞中存在多种基因型，将其PCR产物直接进行测序的话，切割位点下游的序列将会出现多重套峰，每个套峰间两两组合将可以产生数十亿、数百亿种排列组合，难以确定实际的编辑后序列。
上图：混合细胞中存在多种基因型，PCR产物测序出现套峰
下图：野生型细胞，PCR产物测序单一峰型
为了解决这个问题，我们借助了一套智能化算法来准确计算出混合细胞中的实际基因型。其精确度可以媲美NGS测序，能够对Sanger测序数据进行快速的、具有可重复性的分析，且比NGS成本低倍。
该算法的主要逻辑是：
1.将sgRNA和野生型序列进行比对，推断预期的切割位点，并根据Cas9基因编辑产生Indel的特点，围绕着预期切割位点，采用标准的非负线性建模，构建一个庞大的模拟编辑序列库。
2.将预期切割位点上游的野生型序列和实验样品测序结果进行比对，找到二者间不匹配的地方，即找到实际的切割位点，并确定套峰分析区域（实际切割位点上下游的一部分序列）。
3.将实验样品的套峰分析区域与模拟编辑序列库进行比对，通过非负最小二乘回归，从模拟编辑序列库中找到与实验样品测序图谱最吻合的线性组合（即最有可能存在于样品中的序列组合）。计算R2，评估二者的拟合度。
4.由于测序峰图上碱基的峰型高度与该碱基的丰度呈线性相关。因此通过统计每一个位置碱基的峰型高度，可以确定突变位点处碱基在序列总体中的相对丰度。通过标准误差方差-协方差矩阵的二次t检验计算出P值，判定相对丰度评估的显著性。
最终输出：实验样品的编辑效率；被编辑后的序列以及其在样品中的占比；以及本次分析的可信度。
智能分析算法根据测序峰图计算出
1.基因编辑效率:Indel%:94
2.拟合度R2：0.95（拟合度良好）
3.测序样品中的编辑序列及其所占的比例
MixClone?基因敲除细胞的应用案例：
CAR-T细胞的DGK基因敲除及其抗肿瘤活性分析
实验流程:
Day1:CRISPR/Cas9转染CAR-T细胞，敲除DGK基因
Day5:深度测序分析脱靶效应
Day9:抗肿瘤活性分析
Day1:CRISPR/Cas9转染CAR-T细胞，敲除DGK基因
使用CRISPR/Cas9技术在CAR-T细胞上分别对DGKα基因、DGKζ基因、DGKα和DGKζ双基因(DGKαζ)进行敲除。基因编辑效率（Indel）可以达到80%-90%；移码突变的效率分别为66.7%（αKOCAR-T）和59.6%（ζKOCAR-T）。基因水平的敲除效果分析与蛋白水平检测（Westernblot）的结果一致。
Day5:深度测序分析脱靶效应
对基因敲除细胞进行深度测序分析（insilicoanalysis和Digenome-seq），发现无明显的脱靶效应
Day9:抗肿瘤活性分析
CAR-T细胞的杀伤活性分析
用CellTrace标记的U87vIII肿瘤细胞分别与CAR-T细胞共培养，18小时后，收集细胞，计算U87vIII肿瘤细胞的死亡百分率，进行细胞杀伤活性分析。
（AAVS1KOCAR-T细胞作为阴性对照）
实验证明DGK基因敲除的CAR-T细胞(DGKαKO、DGKζKO、DGKαζKO)比对照CAR-T细胞(AAVS1KO)有更显著的细胞杀伤作用。
细胞因子浓度水平测定
用CellTrace标记的U87vIII肿瘤细胞分别与CAR-T细胞共培养，18小时后，收集共培养物的上清，对上清中的细胞因子（IL2、IFNγ）含量进行测定。
细胞因子分泌量（IFNγ和IL2）的分析
DGKαζKO双基因敲除的CAR-T细胞比DGKαKO或DGKζKO单基因敲除的CAR-T细胞分泌更多的细胞因子IFNγ和IL2，DGKαζ双基因敲除协同促进CAR-T细胞的效应功能。
CAR-T细胞增殖能力分析
将经CellTrace标记的CAR-T细胞（AAVS1KO、DGKαζKO）分别与U87vIII肿瘤细胞共培养4天后，收集CAR-T细胞，并和新的U87vIII肿瘤细胞共培养1天。通过流式细胞术分析CAR-T细胞的增殖情况。
结果表明，在肿瘤细胞的重复刺激下，AAVS1KOCAR-T细胞进入衰退状态，几乎不增殖；相反，DGKαζKOCAR-T细胞则越过衰退障碍，成功增殖。
体内肿瘤杀伤活性分析
将1×的U87vIII肿瘤细胞皮下注射到8周大的NSG小鼠体内，皮下注射后第28天和第32天，分别注射5×的CAR-T细胞（T细胞、AAVS1KOCAR-T、DGKαζKOCAR-T）。在第32天到第35天间，每天腹腔注射替莫唑胺。每两周测定肿瘤大小。
结果表明，在肿瘤异种移植小鼠模型中，T细胞和AAVS1KOCAR-T细胞均未能控制肿瘤消退。相比之下，在接种后第56天，DGKαζKOCAR-T细胞可以引起明显的肿瘤消退。
本案例通过CRISPR/Cas9技术敲除DGK基因来提高CAR-T细胞的抗实体瘤能力，为人类癌症免疫治疗提供一种新思路。
本案例也表明MixClone?基因敲除细胞可以用于基因功能缺失性研究、基因通路相关的细胞信号研究、基因敲除细胞的体外成瘤性研究以及细胞增殖能力等研究。具有效率高、周期短、成本低等优势，是新一代的基因功能分析工具。
参考文献：
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Cas9X教授
