Cas9与耐药基因研究是啥关系
By季博
有人说，季博，你写的分享文章真的是很好，把最新的nature文章分析得简单易懂。不过，如果只看标题，没几个人感兴趣。Sign，季博也知道，可还是不想做标题党。这次标题是否好些呢，哈哈。（大家要是觉得季博分析的文章比较好，能够让大家在科研中少走弯路，就多推荐给朋友吧，帮人就是帮己。）
Cas9做耐药基因筛选，其实DrS写过一篇文章“激动人心的cas9新用法”，主要介绍的是cas9-sam的技术。很多人在阅读，不过，季博发现，如何把这个新技术用到我们的研究中去，不少人在课题设计时，并未考虑这个技术。
今天就来聊聊两篇文章，一篇science，一篇nature。（文章全文上传qq群，“Cas9与耐药基因研究是啥关系science.pdf”，“Cas9与耐药基因研究是啥关系nature.pdf”）
“Cas9与耐药基因研究是啥关系science.pdf”文章标题Genome-ScaleCRISPR-Cas9KnockoutScreeninginHumanCells。是去年发在science上的。先看这篇文章。
文章技术的东西季博不多说，说说思路。这样大家在做自己课题设计的时候可以参考着用。
背景：
药物是vemurafenib(PLX)，百度上得知是BRAFVE突变的抑制剂。可用于黑色素瘤的治疗。
细胞，黑色素瘤细胞，A和HUES62。
Fig.1.LentiviraldeliveryofCas9andsgRNAprovidesefficientdepletionoftargetgenes.
对比慢病毒介导的cas9和shRNA在靶基因的抑制上的效果。结果可想而知。Cas9的6个靶点，几乎在一个峰。其实是都knockout了。而shRNA，4个片段，敲减效率不一。这是说明系统的OK性。
Fig.2.GeCKOlibrarydesignandapplicationforgenome-scalenegativeselectionscreening.
重点来了。构建了人的cas9敲除库GeCKO（个基因，每个基因3到4个sgRNA片段）。在黑色素瘤细胞中，进行了负向筛选，negativeselection。啥意思呢。
研究思路是这样的，肿瘤细胞拿过来，加入药物后，细胞是会死的。如果不死，咋起到治疗呢（提醒下大家，临床上的复发转移，其实应该从耐药的角度去研究，如果细胞都杀死了，咋来复发转移呢。）。
把GeCKO感染细胞（慢病毒），然后加药，会有细胞活下来，然后把活下来的细胞进行测序，看是啥基因被knockout后，细胞产生了耐药。其实思路很简单。
Fig.3.GeCKOscreeninAmelanomacellsrevealsgeneswhoselossconfersPLXresistance.
给出了A中的一些数据。
Fig.4.ComparisonofGeCKOandshRNAscreensandvalidationofneurofibromin2(NF2).
拿了一个基因NF2，进行了验证。从D图和E图，大家会发现，用shRNA，看不出NF2和耐药相关。但用cas9就很明显，NF2被knockout后，产生了耐药。其实这个说明，用shRNA时，细胞内还是有蛋白存在的，只是我们的检测手段没能检测出来，蛋白虽然量少，但功能还是存在。但用cas9，是knockout，功能完全丧失。
OK，这是年的science，今年呢有出来一篇nature出来，做啥呢。把cas9上DNA的剪切功能突变掉，加上激活转录的元件。这样用cas9去识别启动子，激活元件来激活转录，从而不受细胞内源调控的去过表达基因（cas9-sam技术）。技术不同，然后也是相同的细胞，相同的药物进行了耐药筛选。看什么基因过表达后，可以产生耐药。（大家注意，如果是某基因发生突变产生耐药，传统做过表达筛选，是筛不出来的，因为不知道突变的情况下，构建的还是野生型基因。而cas9-sam，过表达的是细胞本身内源的基因。只要过表达出来耐药，就能筛选出来。）
关于技术细节，大家可以看原文，如果想采用这两个技术进行研究工作，也可以找公司技术来做个介绍。季博要说的是思路。
Tips：
1、耐药研究，没有耐药细胞株，也可以做。这两篇文章都没有使用耐药株。这样的话，就大大方便了我们进行不同药物的耐药基因研究。（耐药细胞株的筛选真的很费时间。且自己筛选的耐药株，还不一定能得到高分杂志reviewer的认可。）
2、通过这两种方法拿到的耐药基因，临床相关性如何证明呢。是否需要耐药病人的样品。其实吧，耐药病人的样品想收集起来，难度大家想想。给大家一个出路，就拿癌和癌旁来证明临床相关性。因为跟耐药相关，他首先应该是肿瘤相关基因。所以用癌和癌旁来验证其临床相关性。大家可以看下“耐药or药靶or协同药靶-研究，两篇nature文章分享”中的nature文章，就是用癌和癌旁来证明所做耐药基因的临床相关性的。
3、做个广告，公司已经构建了这两个库，重复了文章中的实验，数据很漂亮。大家想发高分文章的，可以赶紧做。Cas9现在正是火的时候，赶潮流。“三阴乳腺癌的潜在药靶-转录调控”分析的这篇cell文章中，季博说了，其研究的深度不深，主要是提出了从转录差异中寻找药靶，其实能发cell还有一个原因是，其功能实验，除了用shRNA外，还大量使用了cas9。
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