生命科学的迅速发展使得我们从生物遗传信息的“读取”阶段进入到后基因组时代，基因组的“改写”乃至“全新设计”正逐渐成为现实。在不断的探索研究中，基因编辑技术已经从最初依赖细胞自然发生的同源重组，发展到几乎可在任意位点进行的靶向切割，其操作的简易和高效极大地推动了物种遗传改造的发展。基因编辑可为合成生命的进一步改造提供手段，为新物种的创造提供更多的可能性。
基因编辑主要包括锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)技术、CRISPR-Cas核酸酶(CRISPR-CasRNAs)技术，它们都能特异性地识别靶位点，对其单链或双链进行精准切割后，并由细胞内源性的修复机制来完成对靶标基因的敲除和替换。由于CRISPR-Cas9系统构建相对容易且细胞毒性小，目前应用最为广泛。
（a）锌指核酸酶（ZFN）基因编辑技术；（b）TALEN基因编辑技术；
（c）CRISPR/Cas9基因编辑技术
CRISPR/Cas系统应用
1CRISPR/Cas9技术
CRISPR/Cas系统原本是细菌和古菌进化出来用于抵御外来病毒及质粒DNA的适应性免疫系统。II型CRISPR/Cas9系统依赖于外源DNA片段在规律成簇的短间隔回文重复（CRISPR）位点整合，其经过转录及剪切后产生短的CRISPRRNAs（crRNAs），crRNA与反式转录的crRNA（tracrRNA）退火结合，然后引导Cas9蛋白介导序列特异性的外源DNA降解[1]。Jinek等[2]发现Cas9发挥靶向切割作用所依赖的crRNA和tracrRNA可以融合为一体，作为sgRNA。随后，若干研究组陆续报道CRISPR/Cas9系统可用于人类细胞的靶向基因编辑[3]。
2CRISPR/Cas9-nickase基因编辑技术
RISPR/Cas9系统使用的crRNA能容受一定程度的错配导致脱靶效应的产生，限制了CRISPR/Cas9系统在高精度编辑中的应用[4]。为了提高Cas9编辑系统的精度，研究者设计了“一个位点，双sgRNA靶向”的策略，即只对HNH或RuvC的其中一个位点进行沉默突变，形成和Cas9nickase，这样就可以用两个不同的nickase对基因组进行锚定和单链剪切造成粘性末端。使用这种策略，可以大大降低CRISPR/Cas9系统的脱靶效率。
3CRISPR/dCas9-FoKI基因编辑技术
同样是为了解决CRISPR/Cas9技术的脱靶问题，Guilinger等[5]采用了dCas9的策略，即对HNH和RuvC活性区域进行突变，使之无法行驶剪切功能而产生DeadCas9(dCas9)，dCas9只能依据sgRNA上的序列附着到特定的基因位点上，而不可以行驶剪切功能。为了实现DNA的切割，引入FoKI核酸内切酶的切割结构域，与dCas9连接做成融合蛋白fCas9。在人类细胞的基因编辑中，fCas9的特异性比野生型Cas9要高得多，同时也大大降低了脱靶效率。
(a)CRISPR/Cas9技术(b)CRISPR/Cas9-nickase基因编辑技术
(c)CRISPR/dCas9-FoKI基因编辑技术
4基于CRISPR/dCas9的单碱基编辑技术
（1）Liu课题组将源自大鼠的胞嘧啶脱氨酶（APOBEC1）与dCas9融合，从而使得胞嘧啶经脱氨基形成尿嘧啶，尿嘧啶在复制过程中被识别为胸腺嘧啶，实现C到T的转换,然后在后续的DNA复制或者修复作用下实现C:G碱基对到T:A的转变[6]。
（2）腺嘌呤经脱氨基形成次黄嘌呤，次黄嘌呤在复制过程中被识别为鸟嘌呤，从而可实现A到G的转换。Liu课题组采用蛋白质进化工程手段对大肠杆菌的tRNA腺苷脱氨酶（TadA）进行改造，他们获得的第7代腺嘌呤碱基编辑器（adeninebaseeditors，ABEs）能高效介导A:T碱基对到G:C转变[7]。
5基于CRISPR/dCas9的基因表达调控技术
除了直接对DNA进行编辑，CRISPR/Cas系统在基因表达调控上也可发挥作用[8]。例如，利用dCas9无核酸内切酶活性但仍能与DNA结合的特点，可直接阻碍其结合DNA与其他因子的结合，影响基因的表达。如果将转录抑制因子或者激活因子与dCas9融合，则可以实现靶基因的抑制与激活，为基因功能研究提供灵活的操作手段。
6CRISPR/Cas12a基因编辑技术
年，张锋团队报道V型系统中的Cpf1（CRISPRfromPrevotellaandFrancisella1）（现称“Cas12a”）是有功能的细菌免疫机制并能在人类细胞中介导有效的基因编辑[8]。CRISPR/Cas12a需要的是富含T碱基的PAM序列，有助于其在基因组富含A/T碱基的物种中使用。陈佳课题组将无DNA切割活性的dCas12a与大鼠源的胞嘧啶脱氨酶（APOBEC1）融合，发现其与基于Cas9的碱基编辑器类似，能有效地催化人类细胞中C到T碱基的转换[9]。由于识别的是富含T碱基的PAM序列，基于Cas12a的碱基编辑系统能与基于Cas9的碱基编辑系统互补，为相关基础研究及将来的临床应用提供更全面的技术条件。
7基于CRISPR/Cas系统的RNA编辑技术
除了对DNA进行编辑，张锋课题组发现CRISPR蛋白家族的C2c2（现称Cas13a）可以靶向切割RNA[10]，随后他们证实Cas13a可在哺乳动物细胞中靶向降低RNA的水平[11]。利用Cas13a的RNA靶向功能，CRISPR/Cas13a系统被开发为RNA检测器用于疾病诊断[12]。张锋团队后续又发现了Cas13b[13]，其同样具有RNA靶向和编辑功能。另外，Cas13c和Cas13d也具有类似功能[14]。RNA编辑技术的建立，进一步拓展了CRISPR/Cas基因编辑技术的应用范围。
参考文献
[1]NishimasuH,RanFA,HsuPD,etal.CrystalstructureofCas9in
