介绍精子鞭毛的多种形态异常（MMAF）是弱畸精症的一个亚类，特征为鞭毛表型异常和精子活性严重受损。最早报道的MMAF遗传学病因为DNAH1双等位变异，至今已经报道了18个基因由不同的机制导致MMAF。但是，只有60%的MMAF病人能获得遗传学诊断，可能存在其他与鞭毛发生相关的基因变异与MMAF有关。在这项研究中，作者对一个包含90例中国男性MMAF病人的队列进行全外显子测序（WES），发现有5例无血缘关系的患者存在CFAP58双等位基因功能丧失变异（LoF）。携带双等位基因CFAP58变异的男性患者有典型的MMAF表型，透射电子显微镜（TEM）发现了显著的鞭毛超微结构缺陷，包括中央和/或外周微管缺失和线粒体鞘畸形。此外，Cfap58敲除的小鼠也表现出了典型的MMAF，包括精子活力严重下降和鞭毛形态异常。这些结果强烈提示了CFAP58双等位基因LoF失变异导致人类和小鼠弱畸精症和男性不育。结果1,在男性MMAF患者中发现CFAP58双等位基因LoF变异作者对一个包含90例中国男性MMAF病人的队列进行WES测序，发现有5例无血缘关系的患者存在CFAP58双等位基因LoF变异，占队列全部人数的5.6%（5/90）（图1A）。CFAP58编码纤毛和鞭毛相关蛋白58，预测由个氨基酸构成，包含两个螺旋结构域（图1B）。CFAP58在睾丸高表达。图12,携带CFAP58双等位基因变异患者的弱畸精症表型在5个患者中4个患者的前向运动精子百分率降到了0,剩下的1个只有2.1%。使用HE染色检测精子的形态，患者表现出明显的MMAF表型，包括鞭毛短、卷曲，无鞭毛和鞭毛直径不规则（图2A）。携带双等位基因CFAP58变异的男性精子中，94%以上的精子鞭毛异常，主要表现为鞭毛卷曲和短鞭毛。之后作者通过荧光染色证明了CFAP58分布于可育对照的整个鞭毛，并大量集中在中段（图2B）。CFAP58双等位基因变异的个体几乎没有CFAP58荧光染色（图2B）。.免疫印迹显示病人没有CFAP58蛋白表达（图2C），这可能是无义突变介导的mRNA降解导致的。这些结果显示CFAP58双等位基因变异导致的CFAP58蛋白缺陷可能导致MMAF相关的弱畸精症。图23,CFAP58蛋白缺陷与轴丝体和线粒体鞘畸形相关轴丝是运动纤毛和鞭毛的核心，由高度保守的“9+2”结构组成，即9个微管（DMT）围绕一对中心微管（CP）。此外，精子鞭毛还具有特殊的轴索周围结构，包括位于中段的螺旋状线粒体鞘（MS），主段的纤维鞘，以及中段和近端的外层致密纤维（ODFs）。图3电镜下对照显示标准的9+2结构，而携带双等位基因CFAP58变异的患者有不同类型的鞭毛缺陷，包括缺乏CP、DMT的丢失、异常ODF和缺陷MS（图3A）。横断面定量显示，有90%以上携带双等位基因CFAP58变异的精子轴突横切面异常，明显高于对照组（图3B）。为了进一步分析精子的超微结构异常，作者检测了患者和对照之间SPAG6（一种中央成对微管的标记物）的差异，免疫荧光分析显示SPAG6定位于对照精子的整个鞭毛，与CFAP58的定位一致;与之相反，SPAG6在携带双等位基因CFAP58变异的男性短鞭毛或卷曲鞭毛中几乎不存在（图3C）。此外，作者还检查了精子鞭毛装配所需的蛋白质SPEF2的定位和丰度。和对照相比，患者的精子鞭毛中几乎没有或只有很少的SPEF2（图3D）。为了验证荧光染色的结论，作者又做了SPAG6和SPEF2的免疫印记。患者的SPAG6和SPEF2有显著的降低或缺失（图3E）。电镜同样揭示了患者精子线粒体鞘的异常（图4A）。为了进一步验证线粒体鞘畸形的严重程度，作者对线粒体伴侣蛋白HSP60进行了荧光染色和免疫印记（图4B和C）。这些发现有力地支持了携带双等位基因CFAP58变体的男性精子细胞普遍存在线粒体鞘畸形。图44,Cfap58-KO雄性小鼠的表型特征作者使用CRISPR-Cas9技术制作了Cfap58-KO小鼠模型，Cfap58-KO雄性小鼠完全不育，但是睾丸的大小和形状和对照组比没有差异。以WT和Cfap58-KO雄性小鼠附睾尾的精子为研究对象，研究了精子的形态特征。与野生型雄性小鼠相比，Cfap58-KO雄性小鼠的精子浓度显著降低，活动率低至零。形态分析显示，CFAP58缺陷精子形态异常，主要为鞭毛短（50.75±1.5%，n=3）和卷曲（39.0±3.7%，n=3）（图5）。图5讨论在此研究中，作者在一个包含90个MMAF病人的队列中发现了5例（5.6%）无血缘关系的CFAP58双等位基因截短变异。WES结果显示在这些携带双等位基因CFAP58变异的男性中，没有其他已知的MMAF相关基因的致病性变异。这些CFAP58变异在人群中不携带或等位基因频率极低，符合常染色体隐性遗传特征。进一步的实验，包括免疫印迹和免疫荧光染色，显示CFAP58在携带双等位基因CFAP58变异的男性精子中是缺失的。因此，这些病例中的MMAF表型可能由CFAP58中的双等位基因LoF变异解释。张梦娜zmn
