美国加州大学旧金山分校免疫学与微生物学系联合加州大学旧金山分校生物化学与生物物理学系于年10月在国际期刊《Science》上发表了题为"FollowingGeneDuplication,ParalogInterferenceConstrainsTranscriptionalCircuitEvolution"的研究论文。
基因复制是一个新基因的重要来源，大多数基因复制模型假设复制前基因的祖先功能是独立的，因此后代的旁系之间可以整齐地划分。然而，许多基因产物，如转录调节因子这种蛋白质的复制和分化的一个自然结果可能是同类之间的竞争干扰。作者认为平行干扰是基因重复进化的常见约束，解决它会产生额外的调控复杂性，需要稳定基因组中的重复基因。
Tips：
Mcm1是一种真菌的MADS-box转录调节因子，它与七个不同的转录调节因子协同结合DNA，控制许多基因的表达，包括编码生殖功能和精氨酸代谢酶的基因。
Mcm1在精氨酸代谢（ARG）基因中的结构因真菌分支而异，在乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）和念珠菌（Candidaalbicans）中，Mcm1同源二聚体通过与辅助因子Arg81特异性结合来调节ARG基因的转录(图1A)；在酵母（Saccharomycescerevisiae）的世系中，Mcm1复制基因Arg80的引入使得酵母的调控结构更为复杂，Mcm1-Arg80异二聚体通过与辅助因子Arg81结合DNA来调节ARG基因的转录（图1B），酵母中其他Mcm1调控的基因集在基因复制后并没有经历调控复杂性的增加（图1C和D）。表明Mcm1和Arg80的基因调控都依赖于与辅因子和DNA形成的强烈相互作用。
图1
为进一步探究Mcm1复制后DNA与辅助因子结合后功能是如何发生分化的，作者重组了原始的MADS-box蛋白，并在体内和体外对这些蛋白进行了分析。将重组的原始MADS-box蛋白整合到酵母中，并移除ARG80和MCM1，以确定原始蛋白是否可以弥补缺失。结果显示复制前AncMADS蛋白弥补了这两个缺陷:用AncMADS替代Mcm1或Arg80在任何以精氨酸前体作为唯一氮源的培养基中的生长都没有影响，其表型依赖于正常的ARG基因调控（图2A）。通过测定Mcm1和Arg80/Mcm1调控基因的表达水平，发现AncMADS恢复了这些基因的激活和抑制，并且大多数基因表现出与野生型相同的动态范围（图2B）。但ARG抑制基因的动态表达范围缩小，α特异性基因的动态表达范围轻度缩小，ARG激活基因CAR2的激活强于野生型（图2B-E）。表明AncMcm1和AncArg80发生了退化突变，因此在进化过程中这两个旁系同源基因都必须被保留。
图2
通过探究AncMADS复制后AncMcm1和AncArg80多样化的突变，发现从AncMADS到AncMcm1的世系中，发生了一个替换（Tyr33→Phe33），且Mcm1后代中都保存了这个基因；在AncMADS到AncArg80世系中，有3个序列在Arg80后代序列中高度保守(图3A)。研究表明，一些残基(T41A,Q42N,F62L;T,Thr;A,Ala,Q,Gln;N,Asn;L,Leu)在稳定Arg81和Arg80以及Mata1和Mcm1之间的相互作用中发挥了关键作用。为探究其对复制前祖先的影响，文章将这些突变引入到AncMADS中，观察它们对ARG基因和α-特异基因表达水平的影响。结果表明，复制前AncMADS可以与Arg81和Mata1同时形成辅因子相互作用，并且这些相互作用在后代旁系中相互退化:AncMcm1失去了与Arg81有效交互的能力，而AncArg80失去了与Mata1交互的能力（图3）。
图3
Arg80和Mcm1具有非常密切的DNA结合特异性，表明在复制之后，MADS-box与DNA结合特异性的差异最多是有限的。复制前AncMADS蛋白可以弥补复制后基因的缺失，这也证实了DNA结合特异性没有发生实质性变化(图2)。然而Arg80对DNA的亲和力远低于Mcm1。为确定亲和力变化发生的时间，测定AncMADS、AncArg80和AncMcm1在DNA上的半衰期，通过使用一种酵母的MADS-box结合位点（一个精氨酸代谢基因），该位点与酵母的Mcm1和Arg80的一致位点很相似，而且该位点已被证明支持这两种蛋白在体外结合。结果显示AncArg80的半衰期明显低于AncMADS和AncMcm1的半衰期(图3D)。因此，Mcm1和Arg80亲和力的差异是由于复制后不久Arg80的DNA结合亲和力降低(图3E)。
文章还探究了Arg80与DNA结合亲和力降低对基因表达的影响，作者推测具有完全DNA结合强度的Arg80可能通过与α特异性基因调控位点结合干扰Mcm1，并通过阻止Mcm1与Mata1协同结合而充当显性负突变体(图4A)。
那么Arg80与DNA结合亲和力的降低将通过α特异基因上的DNA结合来减少竞争，从而有利于Mcm1。通过逆转AncArg80中的5个突变（K1Q，E2A，E7P，F10Y，K25R；K，Lys；E，Glu；P，Pro；R，Arg），在缺乏Arg80的酵母中测定α特异性基因的表达。根据旁系同源基因干扰的假说，AncArg80突变体显著降低了α特异性基因的表达，当过表达时，非突变的低亲和力AncArg80蛋白抑制了α特异性基因的表达，而过表达的高亲和力AncArg80突变几乎完全阻断了α特异性基因的表达(图4B)。Arg80和Mcm1之间的拮抗作用以减弱的形式持续存在，因为酵母中Arg80的缺失会略微增加α特异性基因的表达(图4B)。推断Arg80与DNA结合亲和力的降低限制了α特异性基因上Arg80和Mcm1之间的旁系同源基因的干扰程度。
图4
本文通过将原始基因重组并运用酵母相关的生化和遗传研究方法相结合进行探究，逻辑清晰，故事完整，虽然尚不清楚影响蛋白质间相互作用的突变是发生在之前还是之后，抑或是与影响DNA结合的突变同时发生，但不可否认的是每一种突变都是一种功能缺失或者至少是功能减少的氨基酸替代，文章研究思路值得借鉴，通过关键位点的突变实现功能变化并进一步探究其进化机制，可以作为研究范例进行参考。
基因重复使蛋白质失去祖先的相互作用，导致亚功能化，不可避免地在重复之间会产生负面影响，虽然这种干扰可以被利用，但更常见的结果是在进化过程中持续存在的基因重复中，这种干扰被最小化。与此同时，这种最小化是否又伴随着更加复杂的机制？这也为相关方面的研究提供了一个新的思路。
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