iNature：使用CRISPR-Cas9的组合遗传筛选是发现冗余基因和探索复杂基因网络的有用方法。然而，目前的方法受到单引导RNA（sgRNA）和有限基因靶向活性之间的干扰。为了提高组合筛选的效率，Doench研究组使用来自金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌的直系同源物Cas9酶。Doench研究组使用机器学习来建立金黄色葡萄球菌Cas9sgRNA设计规则，并将金黄色葡萄球菌Cas9与化脓性链球菌Cas9配对，以在细胞中实现双重靶向。Doench研究组还开发了慢病毒载体和克隆策略，以生成高复杂度的汇集双敲除文库，以确定多种细胞类型，包括MAPK通路基因和凋亡基因的合成致死和缓冲基因对。Doench研究组的直系同源方法还使得能够将基因敲除与转录激活结合起来，这揭示了与TP53的遗传相互作用。这里描述的“大Papi”（配对的金黄色葡萄球菌和化脓性互作用）方法将被广泛地应用于组合表型的研究。
绘制基因之间的功能关系是理解疾病状态如何由基因功能障碍引起的关键步骤。在酵母中，高通量的方法使得遗传网络的创建成为可能，有万个双突变体可以鉴定近万个相互作用。在人类细胞中，网络的复杂性要比酵母高出几个数量级，蛋白质编码基因和成千上万种不同的细胞类型的成对组合大约有10倍以上。
系统构建
RNA干扰（RNAi）和CRISPR技术可以同时干扰两个或更多的基因，从而代表一个有前途的方法来揭示遗传相互作用。现在可以使用慢病毒构建系统进行初始组合CRISPR筛选。然而，包括U6启动子在内的慢病毒载体中的重复元件导致高水平的重组，并降低组合筛选效率。尽管另一项研究发现化脓性链球菌tracrRNA序列的多个拷贝，同样倾向于重组，但是实现组合CRISPR筛选的两个努力使用了来自小鼠和人的直系同源U6启动子。最后，因为Cpf1酶处理自己的转录本，他们可以从一个转录本提供多个sgRNAs。然而，在同一个单元中，多个indel的报告效率低于10％，对筛选应用来说太低。在所有情况下，不同的RNA可能竞争加载到一个共同的效应酶，导致整体效率下降。
应用推广
Doench研究组开发了一种方法，依靠来自酿脓链球菌和金黄色葡萄球菌（SpCas9和SaCas9）的正交Cas9酶来克服以前方法的实际限制，并实现稳健筛选的双敲除效率。这种方法揭示了跨越多种细胞类型的合成致死和缓冲关系，以及针对相同基因对的独特sgRNA对之间的良好对应性。由于两个sgRNA独立编程两个不同的Cas9，这种方法可以在同一个屏幕上结合不同的活动，如敲除和过表达（CRISPRa）。Doench研究组预计，大规模组合空间（称为BigPapi）的效应器将在许多模式生物中广泛应用。
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