前言
年，世界上第一个遗传疾病的基因治疗药物Glybera被欧洲药品管理局（EMA）批准，用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症（LPLD），虽然该药物最后因定价太高（万美元，约合万人民币）和需求不足而退出市场，但却代表着基因药物作为疾病治疗的新方法正式应用于临床。年，基因治疗药物Strimvelis被EMA批准用于治疗儿童腺苷脱氨酶（ADA）缺乏性重度联合免疫缺陷症（ADA-SCID）；年，来自诺华公司的Zolgensma获美国FDA批准上市用于治疗脊髓性肌萎缩症。Glybera、Strimvelis及Zolgensma的相继上市证明，遗传疾病不再是不可治愈的疾病。同时，我们注意到，不仅这些上市基因药物，包括目前正在进行的多项基因治疗的临床试验中，都离不开一种工具——病毒载体，它发挥着将外源基因片段递送到人体细胞中的重要功能。本期就着重介绍病毒载体在基因治疗临床上的应用。
01
什么是病毒载体
病毒是一类能对人体细胞及其它动物细胞进行有效感染的微生物。由于其具有良好的基因递送效能，故而被科学家们改造成为进行基因治疗的主要递送工具。目前，病毒载体仍然是基因治疗试验最流行的递送方法，迄今为止，已用于大约三分之二的医学试验。
对于现有的常用基因疗法，无论是在体(invivo)还是离体(exvivo)的基因治疗，它们第一步都是将治疗性转基因/基因编辑工具包装进递送病毒载体，然后通过在某些特定的宿主细胞（如T细胞）中扩增，使得载体浓度达到目的需求。这就是所谓的“包装病毒”。随着技术不断发展和突破，目前已经发展了几种比较成熟的病毒载体系统。
按照时间的发展，在基因治疗中使用最广泛的病毒载体包括逆转录病毒（retrovirus,RV）和慢病毒（lentivirus,LV）、腺病毒（adenovirus,Adv）以及腺相关病毒（adenoassociatedvirus,AAV）等载体。接下来，我们就来一起认识一下！
逆转录病毒RV：是最早应用于基因治疗的一类载体，是一种RNA病毒。逆转录病毒可以把目的基因随机整合入宿主基因组，从而长期稳定表达目的基因。但由于逆转录病毒的随机整合特点，容易干扰宿主基因的正常表达，具有潜在的致瘤风险。因此目前RV载体只被应用于体外递送细胞等方面；
慢病毒LV：属于逆转录病毒的一个分支，由人类免疫缺陷Ｉ型病毒（HIVI）改造而成。LV最大的优势在于其感染范围相对较广。此外，LV整体的可运载容量大（约10kb），适应的疾病类型更丰富。然而，属于逆转录病毒的LV的由于存在随机整合特点，仍然导致其具有潜在的致瘤可能。不过在重度联合免疫缺陷症与地中海贫血疾病的治疗中，LV仍然表现出很好的治疗效果，且目前暂未报道出相应的副作用[1,2]；
腺病毒Adv:是一类无包膜的双链DNA病毒。在临床和科研中，主要使用的是Adv5型腺病毒载体。与上面所述的逆转录病毒不同，Adv不会将基因片段整合入宿主基因组，属于非整合型的病毒载体。不过，Adv在使用中容易引发较强烈的免疫反应，故而在使用中存在一定的限制[3]；
腺相关病毒AAV：是目前应用前景比较广泛的一类基因转运工具。与Adv相同，AAV仍然属于非整合型的载体，递送入细胞的基因片段可以在染色体外稳定表达[4]。不过，由于其导入基因以游离状态存在，故而在细胞分裂中容易丢失。且其衣壳蛋白对应的不同血清型所导致的免疫原性也可能使AAV介导的治疗效果大打折扣。因此，选择恰当的血清型是采用AAV基因治疗的前提。
图1.3种常用病毒的比较
02
病毒载体在基因治疗中的应用
在基因治疗的过程中，载体系统一直发挥着至关重要的作用，所谓的载体系统，即递送外源基因片段的运输工具。如基因治疗的发展初期，曾由于缺乏能够将目的基因高效递送入到细胞的载体而停滞不前，直到RV的出现，这一局面才得以扭转。并且基因治疗的发展曾出现两次重大危机，均与载体技术直接关联。一次是由于使用了免疫原性强烈的腺病毒载体，在病人体内引起了过度的免疫反应并最终导致病人的死亡；另外一次是由于逆转录病毒整合突变效应激活了癌基因，导致接受基因治疗的20名病人当中5位出现了白血病病征。因此科学家也预言，基因治疗未来的发展和突破也必然围绕着载体技术，
那我们上述提到的几种常用病毒，如LV，Adv及AAV等是如何应用到不同疾病治疗，需要结合基因治疗的2种主要方式，有助于进一步理解。
1.体外治疗（exvivotherapy）：将患者的体细胞（如造血干细胞）从体内分离，在体外进行培养并使用携带有正常基因片段的载体修复突变基因，最后通过注射的方法将改良后的细胞回输入患者体内以进行疾病的治疗[5]。这里常会用到慢病毒等整合性载体，因为整合性的载体才能有效将我们需要进行基因工程改造的片段插入细胞的基因组并实现稳定表达。特别是在基于细胞改造的基因治疗上，慢病毒往往备受青睐。
2.体内治疗（invivotherapy）：利用较为直接的方法对局部或全身注射含有修复基因片段的病毒或非病毒载体；这里病毒载体常会用到AAV等非整合型载体。由于临床追求的低风险和体内治疗环境的复杂性，在体基因治疗往往还是优选非整合性载体，而且以非整合性载体为基础的过表达系统仍然是现在上市基因治疗药物的基本通性。
图2.基因治疗策略：exvivo（左）与invivo（右）[6]
上述两种策略在不同组织器官的疾病治疗中各有侧重，为多种疾病的治疗提供了方法学支持，并且已经有了相应代表性的突出成果！
exvivotherapy的代表药物：exvivo疗法主要还是应用于造血系统疾病的治疗（如地中海贫血，镰刀型细胞贫血症，血液瘤等）。CAR-T疗法是目前是离体基因治疗的代表。肿瘤患者接受CAR-T治疗时，医学工作者们首先从患者的外周血中分离得到T细胞，再利用慢病毒等载体将人工编辑或改造的目的基因导入T细胞，得到传说中的CAR-T（详见邦耀实验室CAR-T推文专栏）。在体外将CAR-T细胞培养至一定数量后，再回输给患者，从而达到治疗的目的。CAR-T技术现阶段主要用于血液瘤（非实体瘤）的治疗，上市的主要药物代表是FDA于年批准的Kymriah（诺华公司）和Yescarta（Kite公司）两款产品。不过，目前实体肿瘤的治疗尚属于探索阶段，还需要进一步进行治疗方式的探索与改进；
invivotherapy的代表药物：invivo疗法是大部分遗传疾病的治疗方式。年，来自美国Spark公司的具有跨时代意义的眼部罕见病基因治疗产品Luxturna获批上市，这也是FDA批准的首个基因治疗药物，也是近年来在体基因治疗的代表药物。Luxturna是首例采用AAV作为递送载体的基因治疗药物。它将健康的RPE65基因引入患者体内，产生正常功能的蛋白来改善视力。这种药物不但能治疗先天性黑蒙症，还能够治疗其它由RPE65基因突变导致的眼部疾病。
03
病毒载体在临床应用的最新进展
现在基因治疗的概念已经在许多场合被广泛提及，其实不知道大家是否知道，全球首个获批的基因治疗药物诞生于中国。它的名字叫Gendicine?（中文译名：今又生），由深圳SiBionoGeneTech（赛百诺基因）开发，用于治疗携带p53基因突变的肿瘤患者。今又生是一种携带正常p53基因的复制缺陷型腺病毒(Ad-p53)，中国国家食品药品监督管理局（NMPA）于年10月16日批准了它用于头颈部鳞状细胞癌的治疗，是基因治疗的一个先驱产品[7]。
年之后，基因治疗药物沉寂了较长一段时间，自年Glybera获批让大家又将
