5个数据平台分析囊括了32种癌症的例患者的TP53突变效应
在TP53突变的癌症中，超过91%的患者同时丧失了两个功能性TP53等位基因
TP53突变影响基因组稳定性、整体RNA、miRNA和蛋白质表达
p53突变的RNA表达特征有助于11种癌症的预后预测
2.研究背景p53抑癌蛋白是一种转录因子，在多种应激条件下抑制细胞分裂或存活，是细胞抗癌防御的关键安全机制。大多数TP53突变发生在DNA结合区域中心，导致转录因子功能失活。p53通路受到许多上游调控因子的影响，也调节许多在转录和非转录上的靶点。p53的调节因子包括稳定或破坏p53的结合蛋白，以及转录后修饰p53并激活、失活或调节其功能的酶。p53转录靶向数百个基因，特异性取决于细胞类型、环境以及细胞应激源的性质和强度。p53上调编码细胞周期抑制剂、凋亡诱导剂、DNA修复蛋白、代谢调节剂的基因。p53蛋白也下调了与细胞周期进程相关的基因，这一过程涉及CDKN1A/p21依赖的间接基因调控机制。
临床上，TP53突变与一些癌症较差的预后有关，但这仍存在争议。许多变量，如癌症类型、临床分期、研究规模或TP53突变检测的质量，可以影响预后。TP53突变状态并不总是表明p53在癌细胞中的信号状态。例如，p53信号通路可以通过非突变机制减弱，如扩增p53阴性调控因子MDM2、MDM4或PPM1D。因此，更准确地读出p53在人类癌症中的功能，而不是严格地基于TP53基因突变，可能会使预后预测更准确。
3.结果解读3.1TCGA中的TP53突变谱与UMD_TP53数据库的相似通过分析TCGA中例患者TCGA患者全外显子组序列的TP53突变，识别出例TP53突变的患者，其中卵巢癌和子宫癌肉瘤的突变率大于90%，7种癌症类型的突变率小于5%，与UMD_TP53数据库中Sanger测序检测到的突变谱大致相似(图1A)。
TCGA数据集中观察到密码子,和的热点突变最频繁(图1B、图S1A)，大多数TP53突变发生在DNA结合的中心区域，包括Exon4-8（图1C），这些均与UMD_TP53数据库报道的一致。
结合TCGA和UMD_TP53数据库的TP53SNVs，绘图展示编码全长p53的个TP53三联体中九种可能的密码子变化的片段(图1D)。中心区域显示了几乎在每个位点九种密码子中都有至少六种突变，而在N-和C-端的位置没有任何密码子变化。（N端无突变区与p53的MDM2结合区域密切相关，MDM2是介导p53降解的E3泛素连接酶，该结合位点的突变会稳定p53。C端结构域突变抵抗的机制尚不清楚。密码子L1环的缺失证实了先前报道的这个位点的TP53变异很少或没有功能影响。）
在p53的三维结构中，有害的TP53变异体聚集在p53蛋白的特定区域，如loopL2和L3，以及部分螺旋环的螺旋，包括sheetS10和HelixH2(图1E)。这些区域在UMD_TP53突变数据库和TCGA数据集中高度富集，变体几乎在每个密码子上都显示出主要的功能(图1E)。特别是loopL3对DNA结合至关重要，表现出最大数量的突变。
3.%以上的TP53突变的TCGA癌症发生两个等位基因的失活肿瘤抑制基因在遗传水平上被认为是隐性的，两种肿瘤抑制等位基因的失活通常是致癌表型所必需的。而TP53是一种肿瘤抑制因子，有证据表明TP53的错义突变导致一种构象改变的稳定蛋白的表达，该蛋白对野生型p53蛋白表现出主要的负性活性，并获得致癌活性。因此，只有一个TP53等位基因的突变可能导致显著的致癌表型。
为了评估TCGA数据集中的TP53等位基因状态，本文使用WES数据和拷贝数数据对TP53突变瘤进行了综合分析。首先，检测了10%的具有两个不同的TP53突变的肿瘤(/)。对TP53突变的功能分析显示，这两个突变通常都是失活的(图2A)。为了确定两个TP53突变是否在同一等位基因上(cis)或不同等位基因(trans)上，检测了单独的DNA测序reads。单个reads一致显示两种突变的肿瘤被认为是cis，而始终只显示两种突变中的一种的肿瘤被认为是trans。具有代表性的cis和trans肿瘤的read文件如图2B所示。在这35例双等位基因TP53突变紧密相关突变的肿瘤中，28例(80%)为trans,7例(20%)为cis(图2C)。进一步对拷贝数状态进行评估，发现7个cis肿瘤中6个出现TP53拷贝数缺失，28例trans肿瘤中27个出现TP53拷贝数缺失，保留了二倍体TP53状态(图2C)。因此，cis肿瘤中对野生型TP53等位基因缺失有选择，而对trans突变型TP53等位基因缺失无选择。
此外，还检查了TCGA癌症中TP53拷贝数，分类为0、1或2+(图2D)。进一步观察TP53DNA拷贝数在TP53突变肿瘤中的状态，66%的肿瘤出现TP53拷贝数丢失，而34%的肿瘤TP53拷贝数明显为二倍体。分析多个癌症类型的单个DNA序列的TP53突变，发现在TP53等位基因拷贝数丢失的肿瘤中，TP53reads的平均变异(突变)等位基因分数(VAF)接近1.0(图2E,2F)。
3.3TP53突变与染色体不稳定性增加显著相关本文检查了10,例TCGA肿瘤中每个肿瘤+基因座的拷贝数数据，并根据TP53状态对这些数据进行分层。如果拷贝数值大于正常拷贝数的4倍(拷贝数值大于2)，则认为是扩增，拷贝数值小于1被认为是深度缺失。本文绘制了TCGA野生型和突变型的TP53肿瘤扩增和深度缺失在整个基因组中的比例(图3A)。可以看出在所有TCGA癌症的整个基因组中，突变型TP53肿瘤的缺失和扩增总数大约是野生型TP53肿瘤的2.5倍(p=0)（图3B）。当比较不同肿瘤类型的相对TP53依赖性基因组不稳定性时，突变型TP53肿瘤在23种肿瘤类型的19种中明显表现出更多的染色体不稳定性（图3C）。
进一步检查扩增和缺失的频繁区域时，主要的致癌基因和抑癌基因通常位于两者的中心。同样，这些扩增和缺失在TP53突变肿瘤中更频繁（图3E,F）。一个显著的例外是MDM2、MDM4和PPM1D位于中心的三个经常扩增区域，这三个区域在野生型TP53肿瘤中明显扩增（图3F）。所有野生型TP53肿瘤中全外显子突变的中位数为68，而突变型TP53肿瘤中全外显子突变的中位数为（图3G）。
3.4RNA,MicroRNA和蛋白质的整体比较揭示了p53在癌症中的依赖通路由于p53是一种转录调控因子，本文接着比较了野生型和突变型TP53肿瘤中每种癌症类型的基因表达模式（图4A-D）。本文直接比较了每个基因的RNA表达水平，通过t检验将野生型和突变型TP53肿瘤中上调和下调最显著的基因进行了排序。在野生型TP53肿瘤中上调最高的20个基因中，有14个是p53上调的靶基因，P53目标基因EDA2R、RPS27L和SPATA18在21种不同的野生型TP53肿瘤中均显著上调(图4A)。为了基于个体基因表达差异进行通路分析，本文接着在野生型TP53肿瘤中相对于突变型TP53肿瘤找出了个最一致上调的基因，并进行了基因集富集分析。如图4B所示，野生型TP53肿瘤中大多数显著增强的通路都涉及p53相关的信号通路。使用上述类似的方法，在突变的TP53肿瘤中识别出了最一致的上调基因，20个最一致上调的基因中，除了一个之外，其余的都与细胞分裂调节直接相关，大部分基因也在促进细胞周期中发挥作用(图4C)。对突变TP53肿瘤中最上调的个基因进行GSEA分析，结果显示直接参与促进细胞周期进展的通路显著富集(图4D)。
本文还比较了差异microRNA的表达，因为p53已知可以转录靶向许多特定的mirRNA。在野生型TP53肿瘤中持续上调的前20位microRNAs中，有6位是p53的直接转录靶点（图5A）。对前20位miRNA的文献检索表明，其中16个在其他实验环境中与抑癌活性相关。在突变TP53肿瘤中持续上调的20个miRNAs中，有9个在实验中与致癌功能相关（图5B）。
对突变型和野生型TP53癌症中上调的miRNAs的基因靶点进行的检测表明，野生型TP53癌症中，存在增强凋亡、p53信号、缺氧以及抑制细胞周期进展和NOTCH信号通路的miRNAs富集(图5C)。相比之下，在突变TP53癌症中富集的miRNAs似乎可以促进细胞周期进展并减少细胞凋亡(图5C)。本文还比较了TCGARPPA数据，以确定TP53突变状态是否影响蛋白表达。在TP53突变肿瘤中，还观察到与细胞周期进展相关的蛋白显著上调，如cyclinB1、cyclinE1、FOXM1和CDK1（图5D）。
3.5与TP53突变状态相关的基因组改变因癌症类型而异为了对与TP53突变具有相似致癌终点的畸变进行分类，本文识别了与TP53相互排斥的基因组改变。为此，使用了互斥算法，该算法执行搜索功能来识别具有最大互斥性得分的遗传改变模块(图6A)。利用突变数据和拷贝数数据对32种癌症进行分析，发现了所有涉及TP53的互斥模块。通过对PathwayCommons数据库的搜索，确定了TP53与部分互排性基因之间已知的通路相互作用(图6B)。
与TP53相互排斥的突变和拷贝数改变如图6C所示。在大多数情况下，TP53与已知的驱动基因是相互排斥的。
3.6开发一个对预后有用的TP53突变体特征有研究表明，在某些情况下，TP53突变与较差的预后有关。本文初步将TCGA肿瘤分为野生型和突变型TP53类别时，检查了TP53突变对总生存率的影响。对于大多数TCGA癌症类型，突变型和野生型TP53癌症的总生存率没有显著差异(表S7A)，但这可能是由于部分TCGA患者群体的临床随访有限。
因此，本文试图开发一个与TP53突变相关的表达特征，可能更具有预测预后的能力。本文检测了突变TP53癌中持续上调的4个细胞周期调节基因CDC20、CENPA、KIF2C和PLK4的突变p53表达特征(图4D，arrows)。根据肿瘤分型对这四个特征基因的相对RNA表达进行排序，并将它们的的排序得到最终的特征评分进行了平均。高特征分数与TP53突变状态有很好的相关性。对于每一种有足够TP53突变数量的癌症类型，比较了在突变TP53特征表达分数的底部四分位数和顶部四分位数中的患者的总生存率。发现在24种肿瘤中13种具有高p53特征，与低特征肿瘤比，总体生存率显著降低(图7A-7D)。在这11种癌症类型中，有8种类型的突变TP53特征明显比TP53突变状态更能预测预后不良(图7B、7D)。两种有代表性的肿瘤，低级别胶质瘤(LGG)和皮肤黑色素瘤(SKCM)，显示了TP53突变与p53特征的强相关性(图7A和7C)，但p53特征远比TP53突变状态更具预后性(图7B和7D)。本文还使用基于web的软件程序Kaplan-MeierPlotter，使用四种基因特征名对16种TCGA癌症类型进行分析，发现本文的预后计算与基于Kaplan-Meierploter的计算之间存在很强的相关性(表S7B)。
4.文章总结本文通过对TCGA中32种癌症的例样本的5个数据平台分析，以全面评估这些癌症中p53通路的参与情况。发现TP53突变与染色体不稳定性增强相关，包括癌基因扩增增加和抑癌基因深度缺失。TP53突变的肿瘤在RNA、miRNA和蛋白表达模式上与未突变的肿瘤不同，突变的TP53肿瘤表现出细胞周期进展基因和蛋白的增强表达。在11种癌症类型中，突变的TP53RNA表达特征显示与生存率降低显著相关。因此，TP53突变对肿瘤细胞基因组结构、表达及临床前景具有深远的影响。
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