作者：刘朝晖崔凯杨琳梅周洲
我国心血管发病率、死亡率持续攀升，已经成为危害我国人民群众生命和健康的重大疾病[1]。临床上常规使用的抗凝药、抗血小板药、降脂药、血管扩张药等普遍存在个体差异[2,3,4]，随着药物基因组学研究的深入[5,6,7]，开展与药物治疗相关的基因多态性检测，可为临床选择合适的药物，极大地提高心血管药物使用的安全有效性。目前，在临床检测中，心血管病相关基因检测涉及药物包括氯吡格雷、华法林、他汀类、叶酸、硝酸甘油和降压类等[8,9,10]。21世纪，基因检测技术已经得到了长足的发展，如荧光定量PCR、数字PCR、基因芯片、Sanger测序、NGS等技术均不同程度地应用于临床检验领域。事实上，临床诊断正在向"组学"方向（多基因、多位点）发展[11]；另一方面，能够进入临床应用的都是基因意义明确、指南规定、临床可治疗的位点组合，因而临床急需一种能够承接同时检测多基因、多位点的分析检测技术，并拥有检测通量灵活，灵敏度高、成本低、简单易行的特点，应对临床的广泛需求。近些年，飞行时间质谱多基因检测技术快速发展，它结合了质谱技术的高灵敏度、高特异性和芯片技术的高通量和低成本特性，能够精确分辨A、T、C、G碱基之间的质量差异，适用于多种基因变异类型检测，在药物基因组学、肿瘤基因突变检测、肿瘤液体活检、遗传病筛查等领域有广泛应用前景。目前这种多基因多位点检测平台尚未见临床应用。心血管疾病病因复杂，治疗往往涉及多种药物及代谢调控，尤其适合飞行时间质谱多基因检测平台的应用场景，可通过一次检测实现对多种心血管药物基因分型。目前尚未见到关于多基因多位点检测性能验证方案的报道。本研究以心血管药物常见基因检测为代表，结合飞行时间质谱多基因检测平台特点，参照《CNAS-CL02-A医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》进行性能验证研究，针对标本选择，位点选择，以及抗干扰实验方案进行设计：包括已测标本符合率、准确度、特异性、测定下限、精密度及气溶胶污染的抗干扰评价，首次建立了一个多基因多位点性能验证方案，为今后飞行时间质谱多基因检测平台性能验证规范和标准的形成奠定基础。材料与方法一、材料1．标本：选择年9月至年10月来自中医院已测部分心血管药物相关基因位点的DNA标本例和全血标本20例，入选标准：4度保存72h以内的具有明确溯源性的全血标本；科室保存的具有明确溯源性冻存的DNA标本；研究者认为可以使用的标本，受试者年龄、性别不限。排除标准：标本收集时间或信息不明确；试验操作中因失误导致标本量不足检测者；不符合标本采集、处理要求和保存期限的标本；重复入组的标本；标本信息不全或无法溯源的标本。本研究通过中医院伦理委员会的批准（伦理编号：-）。2．主要仪器：NP-C型核酸提取仪（天隆科技）；DP-TOF型飞行时间质谱检测系统（浙江迪谱诊断技术有限公司）、Nanodrop分光光度计（美国ThermoFisherScientific公司）、Veriti96PCR仪（美国AppliedBiosystems公司）、SorvallST16RCentrifuge离心机（美国ThermoFisherScientific公司）、Vortex-Genie2漩涡混合器（美国ScientificIndustries公司）、eppendorf移液枪（德国eppendorf公司）、ESCO生物安全柜（新加坡艺思高公司）。3．试剂：DNA提取试剂：全血基因组DNA提取试剂盒（天隆科技）；飞行时间质谱检测试剂：iPLEXProReagents（美国AgenaBioscience公司），检测心血管相关药物的11个基因共17个位点分别为：华法林：VKORC1（c.CTrs、c.-GArs），CYP2C9（c.CTrs1753、c.ACrs）；氯吡格雷：CYP2C19（c.GArs、c.GArs、c.-CTrs）；硝酸甘油：ALDH2（c.GArs）；高血压类药物：CYP2D6（c.CTrs），ADRB1（c.GCrs），AGTR1（c.ACrs），ACE（bpdeletionrs）；叶酸：MTHFR（c.CTrs）；他汀类：APOE（c.TCrs、c.CTrs），SLCO1B1（c.AGrs、c.TCrs）；Sanger测序试剂：GoTaqHotStartPolymerase（美国promega公司），dNTP（翊圣生物）。二、方法（一）已测标本符合率选择年9月至年10月来自中医院已测部分心血管药物相关基因位点的DNA标本例，用飞行时间质谱检测系统的默认参数和配套检测试剂进行检测，检测结果与已知位点结果进行比对，以已测结果为准，计算本检测结果与已检测结果的总符合率、各基因型的符合率。（二）准确度评价选择20份全血标本，提取DNA后，使用飞行时间质谱检测平台对心血管药物相关11个基因进行突变检测，加样量为2μl。与Sanger测序法检测结果进行比对，通过kappa分析评价飞行时间质谱平台结果的准确性。（三）特异性评价从份已测DNA标本中筛选10份标本（包含11个基因17个位点野生型），重复10次，进行基因检测。（四）测定下限评价从份已测DNA标本中筛选4份标本（包含11个基因17个位点杂合型），用Nanodrop进行浓度检测。分别稀释至、50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.2、0.1ng/μl。各梯度重复3次，评估每个梯度的基因位点检出情况。（五）精密度评价从份已测DNA标本中筛选14份标本（包含11个基因17个位点所有常见基因型）进行检测，添加空白对照，每份标本重复2次。连续测定5天，评价每份标本位点的批间精密度；同一批标本重复测定10次，评价每份标本位点的批内精密度。（六）抗干扰评价从份已测DNA标本中筛选代表性杂合型峰形为高低峰（APOEc.TC）和等高双峰（MTHFRc.CT）的野生和纯合突变标本各1份，将位点APOEc.TC和MTHFRc.CT为纯合突变标本DNA或PCR中间产物梯度稀释后，分别混入到同一位点为野生型DNA中，检测结果的抗干扰情况。1．基因组DNA交叉污染：分别将纯合突变型和野生型标本DNA按照1∶1、1∶4、1∶9、1∶19、1∶49、1∶99、1∶的质量比混合（PCR体系总DNA质量20ng），取2μl加入反应体系上机扩增，重复3次，评价基因组DNA交叉污染对结果的影响。2．PCR产物交叉污染：将纯合突变型标本PCR产物（45循环后的产物大约拷贝/μl）梯度稀释至、、、、、、拷贝/μl，取2μl野生型基因组DNA标本和0.5μl梯度稀释好的突变型标本的PCR产物加入反应体系，重复3次，评价PCR产物交叉污染对结果影响；另外，直接对梯度稀释好的扩增产物进行扩增，评价尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG）降解PCR产物能力。3．消化产物（SAP）交叉污染：将纯合突变型标本消化产物（45循环后的产物大约拷贝/μl）梯度稀释至、、、、、、拷贝/μl，取2μl野生型基因组DNA标本和0.5μl梯度稀释好的突变型标本的SAP产物加入反应体系，重复3次，评价SAP交叉污染对结果影响。4．延伸产物交叉污染：将纯合突变型标本延伸产物（45循环后的产物大约拷贝/μl）梯度稀释至、、、、、、拷贝/μl，取2μl野生型基因组DNA标本和0.5μl梯度稀释好的突变型标本的延伸产物加入反应体系，重复3次，评价延伸产物交叉污染对结果影响。5．转板、撕膜交叉污染：分别将纯合突变型和野生型最终反应体系产物按照1∶1、1∶4、1∶9、1∶19、1∶49、1∶99、1∶的体积比混合，加入到孔板中，重复3次，评价转板、撕膜交叉污染对结果的影响。6．点样及检测过程中芯片基质间交叉污染：将纯合突变型标本K2和野生型标本K1及阴性对照NTC排布于芯片相邻的基质点处，每24个点为一组，每组包括10个K1，10个K2和4个NTC，重复10次，评价芯片相邻基质间有无交叉污染。结果一、已测标本符合率份标本中，已测基因位点数为个，将检测结果与已测结果对比，发现APOEc.TC位点有3个检测结果与已知结果不符，APOEc.CT位点有1个检测结果与已知结果不符，将以上4份不符合标本DNA使用飞行时间质谱平台复测，同时进行Sanger测序验证，结果均与已知结果一致。总符合率为99.91%（/），各基因位点符合率均大于99.5%，结果详见表1。表1飞行时间质谱平台检测例已测标本基因位点符合率二、准确度评价使用飞行时间质谱平台和Sanger测序法对20例全血标本的心血管药物相关11个基因17个位点分别进行检测，以Sanger测序法检测的结果作为比对方法，飞行时间质谱平台检测作为实验方法，通过分析两者相关性，评价飞行时间质谱平台检测的准确性，共检测个位点，其中突变型和野生型分别为个和个。结果如表2所示。飞行时间质谱平台与Sanger测序的结果完全一致，Kappa=1，说明两方法间具有良好的一致性。表2飞行时间质谱平台与Sanger测序法检测结果的一致性比较（位点数）三、特异性评价10份标本（包含11个基因17个位点野生型）检测结果表明，所有野生型标本基因位点结果均为野生型，特异性%。四、测定下限评价4份标本（包含11个基因17个位点杂合型）检测结果表明，当浓度为0.1ng/μl时，SLCO1B1c.AG有2份标本未检出，ADRB1c.GC和CYP2C19c.-CT各有1份标本检测错误，APOEc.CT有1份标本未检出，其他浓度检测正常；当浓度为0.2ng/μl时，4份标本所有位点均能正确检出。此时DNA加入体积为2μl，因此测定下限为0.4ngDNA。五、精密度评价14份标本（包含11个基因17个位点所有常见基因型）检测结果显示，批内精密度和批间精密度均为%，检测性能稳定。六、抗干扰评价反应体系对基因组和PCR各中间产物气溶胶有很强的抗干扰能力，UNG酶的降解能力为拷贝/μl的气溶胶，芯片不同基质间无交叉污染，可以保证检测结果准确可靠。结果详见表3。表3飞行时间质谱多基因检测系统抗干扰评价结果讨论随着药物基因组学的发展，利用遗传信息进行个体化治疗已经得到临床的极大
