海星第三代CRISPR基因敲除试剂盒
Cas9x3.0
让基因敲除更简单、更高效！
产品介绍CRISPR基因敲除试剂盒(Cas9x3.0)是海星生物在多年基因编辑服务的基础上研发的高效快捷的基因敲除试剂盒。包括了人(Human)和小鼠(Mouse)的所有基因的敲除。Cas9x3.0试剂盒包含2个Cas9X?算法优化的gRNA序列载体和特异的同源DNA片段，DNA片段含有抗性和GFP荧光，并携带有一段特殊同源序列，不仅可为后续基因敲除细胞的筛选提供药物抗性，也可以通过流式筛选获得敲除细胞。Cas9x3.0试剂盒对分裂细胞和非分裂细胞都有非常高的敲除效率。原理介绍CRISPR基因敲除试剂盒(Cas9x3.0)依据HDR和NHEJ修复原理进行产品开发。优化的gRNA引导Cas9蛋白对特定位点进行切割，产生DNA双链断裂（Double-StrandBreak,DSB），并诱导同源线性化DNA片段（携带抗性基因和荧光基因）整合到该位点，再通过抗性药物（puroR）或荧光（eGFP）进行筛选，从而获得基因敲除的细胞和单克隆。CRISPR基因敲除试剂盒(Cas9x3.0)的敲除效率是传统基因敲除策略的2~5倍。因为其独有的敲除策略是通过在基因位导入DonorDNA（puroReGFP）从而达到敲除目的蛋白效果，同时也可以在DSB位点导入序列移码，导致蛋白翻译提前终止。这两个原理的叠加，可以轻松获得“等位基因”纯合敲除细胞株。技术原理应用流程CRISPR基因敲除试剂盒(Cas9x3.0)操作步骤(脂质体转染法)：本试剂盒建议采用转染试剂是Lipofectamine?Reagent(cat#-)，具体参照转染试剂说明材料。不同类型的转染试剂，请按照制造商的操作说明进行转染。注意：悬浮细胞不推荐使用脂质体转染法。CRISPR基因敲除试剂盒(Cas9x3.0)操作步骤(电转化法)：本试剂盒推荐Neon转染系统，具体参照设备对每种细胞参数。不同类型的电转设备，请按照制造商的操作说明进行优化。注意：悬浮细胞推荐使用电转化法。CRISPR基因敲除试剂盒(Cas9x3.0)配有eGFP对照DNA，可以按照实际使用的方法和细胞情况，进行实验摸索，建议48小时后的目的细胞的eGFP的阳性率不低于50%，Cas9x3.0试剂盒才能获得最佳敲除效果。产品应用PCR操作流程细胞操作流程单克隆和细胞检测细胞单克隆检测方案：1、极限稀释法：按照每个孔2~3个细胞进行稀释，并将有增殖的克隆转移到96孔中扩增和PCR检测；2、克隆环法：按照5%的汇合度接种细胞，让细胞形成完整的独立的单克隆团，使用克隆环进行消化和扩增和PCR检测；3、流式筛选法：通过流式分选的方式，将带有GFP荧光的细胞分选到每个孔中，并进行扩增和PCR检测。成功案例分析Cas9X海星生物
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