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引用本文:罗巍,陈思.神经系统遗传病的基因检测策略[J].重庆医科大学学报,,7(46):-.
近年来，各种基因检测技术包括单基因测序、基因Panel、全外显子组测序和全基因组测序等被广泛应用于神经系统遗传病的诊断中。基因检测技术的快速发展使临床医生能够探索表型更为复杂、遗传异质性更大的疾病，帮助他们对疾病作出快速且精准的诊断。本文旨在帮助临床医生在种类繁多的基因检测技术中选择合适的方法辅助诊断神经系统遗传病。神经系统遗传病；基因检测；方法神经系统遗传病种类繁多，且基因型-表型关系复杂，一个基因常与多种表型有关，如PMP22基因，其上发生片段缺失会导致遗传性压力易感性周围神经病，若该基因发生片段重复则又引起腓骨肌萎缩症[1]；而一个表型也常有多个致病基因，如多巴胺反应性肌张力障碍，其致病基因有GCH1、SRP和TH等，它们因在多巴胺合成通路的各个环节中发挥作用而致病[2]。近年来，各种新兴基因检测技术帮助临床医生发现和识别大量与神经系统遗传病相关的致病基因和表型，提高了人们对遗传病的认识，使临床诊断变得更加高效和精准。因此，在神经系统遗传病中合理应用基因检测尤为重要。它不仅可以帮助明确临床诊断，也为后续的治疗带来希望，同时还能够指导家庭优生优育。本文从各种基因检测方法的适用范围、表型对基因检测的影响、基因检测报告的解读以及目前基因检测中还存在的问题进行简要概述。1不同基因检测技术适用于不同的变异类型
1.1单基因测序
单基因测序（singlegenetesting）可选择的检测手段主要有一代测序（sangersequence）、多重连接探针扩增技术（multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA）、重复引物PCR（repeat-primedpolymerasechainreaction，RP-PCR）、长片段PCR技术（long-rangePCR）及Southernblot等。一代测序可用来检测单个基因编码序列上发生的错义突变（missense）、同义突变（synonymous）、无义突变（nonsense）、小片段的插入/缺失突变（smallinsertions/deletions）和剪接位点突变（splicing）[3]；MLPA则用来检测基因上的拷贝数变异（copynumbervariation，CNV）；RP-PCR可以检测DNA上的重复序列发生不稳定性扩增，即动态突变（dynamicmutation）。当患者具有以下特征时，临床医生可优选单基因测序[4]：①明确的家族史；②临床表型和其他检验、检查结果都指向某一种特定类型的疾病；③该疾病目前仅有1个致病基因或某个基因上的致病突变最为常见；④患者经济条件受限。一代测序适用于大多数基因测序，用于发现目标片段（＜1kb）上的点突变，曾被认为是过去十年临床基因检测的“金标准”[5]。例如肝豆状核变性（Wilsondisease，WD），它是一种常染色体隐性遗传的铜代谢疾病，ATP7B是其唯一的致病基因，参与铜转运过程，78%的患者中存在p.RL、p.PL和p.TM三个突变。因此，对临床上可疑的肝豆状核变性患者选用一代测序直接检测ATP7B基因不失为一种快速、敏感且价格低廉的基因检测方法[6]。又如发作性运动诱发性运动障碍（paroxysmalkinesigenicdyskinesia，PKD），典型临床特征为儿童期起病的由随意运动诱发的短暂性单侧或双侧不自主运动，包括肌张力障碍、舞蹈样动作或手足徐动症等。曹立等[7-8]发现约1/3的PKD患者携带常染色体显性遗传致病基因PRRT2上的突变，其中c.dupC（p.ArgProfs*8）引起的移码突变所占比例高达76.47%，因此可直接对临床高度怀疑为PKD患者进行PRRT2基因的一代测序。此外，一代测序还多用于已明确致病突变的先证者家族成员的共分离验证。但是一代测序结果阴性只能排除目标区域的特定突变，对于大片段插入、拷贝数变异、多核苷酸重复扩增或非编码区序列突变等则不适用[3]。另外，对于外显子数目较多的基因，使用该方法测序费时费力。MLPA技术多用于致病基因以拷贝数变异为主的疾病，例如腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth，CMT），它是最常见的遗传性周围神经病之一，其发病率约为1/。CMT的经典表型发病年龄多在10~20岁，临床特征主要为肢体远端无力、感觉减退和足部畸形[9]。目前报道和CMT相关的致病基因多达余个，其中最常见的致病突变是染色体17p11.2区域上1.5Mb范围的大片段重复，该区域包含编码周围髓鞘蛋白的PMP22基因。据文献报道PMP22基因突变占CMT1型的70%，在所有CMT病例中占比高达50%[10]。樊东升等[11]运用MLPA技术同时结合一代测序对个中国CMT家系测序，发现PMP22基因重复占29.5%，而PMP22基因点突变仅占2.2%。由此可见，对于临床上可疑的CMT患者可以优先选择MLPA技术对PMP22基因进行检测，若首选全外显子组测序，虽可提高CMT相关的其他致病基因检测率，但因其检测技术的缺陷极易漏诊PMP22基因上的拷贝数变异。此外，X连锁隐性遗传的杜氏肌营养不良（Duchennemusculardystrophy，DMD）常在儿童早期发病，表现为近端肌无力、小腿肥大和肌酸激酶明显升高。它的致病基因为DMD，其中由该基因上的大片段缺失导致的病例可达65%~70%，多发生在突变热点区域45~53号外显子[12]，因此临床上也常优先选择MLPA。导致常染色体隐性遗传的脊髓性肌萎缩（spinalmuscularatrophy，SMA）的致病基因SMN1，其上约96%的突变均为7号外显子的纯合缺失[13]；以及痉挛性截瘫（hereditaryspasticparaplegia，HSP）最常见的致病基因SPG4，其上20%~25%的突变形式为拷贝数变异[14]。所以对拷贝数变异为主的致病基因检测，临床上多选择方便且价格较低的MLPA。RP-PCR、长片段PCR、Southernblot及长读长测序技术（long-readsequencing，LRS）都可用于检测多核苷酸重复扩增突变。自年，首次发现FMR-1基因5’非翻译区（untranslatedregion，UTR）的CGG重复扩增可导致脆性X综合征（fragileXsyndrome，FXS）以来，陆续发现多种疾病与多核苷酸重复突变相关[15]。多核苷酸重复扩增突变可发生在编码区上，如脊髓延髓性肌萎缩（spinalandbulbarmuscularatrophy，SBMA）由AR基因1号外显子上的CAG重复扩增致病[16]、亨廷顿病（Huntingtondisease，HD）由HTT基因编码区的CAG重复扩增致病[17]；也可以出现在UTR区或内含子上，如强直性肌营养不良（myotonicdystrophy，DM）分为DM1型和DM2型，致病突变分别为DMPK基因3’UTR区的CTG重复[18]和CNBP基因1号内含子CCTG重复[19]。近年来多核苷酸重复扩增已成为国内外研究热点，年发现家族性皮质肌阵挛性癫痫（familialcorticalmyoclonictremorwithepilepsy，FCMTE）1型由SAMD12基因内含子区域的五核苷酸重复（TTTCA）扩增致病[20-21]，后续多个研究团队相继报道不同基因（STARD7[22]、MARCH6[23]、YEATS2[24]、TNRC6A[20]及RAPGEF2[20]）内含子上的TTTCA重复突变可引起不同的FCMTE亚型。年英国团队鉴定出伴神经病变和前庭反射消失的小脑性共济失调综合征（cerebellarataxia，neuropathy，vestibularareflexiasyndrome，CANVAS）的致病突变为RFC1基因内含子区的AAGGG重复扩增，该疾病是一种罕见的晚发型共济失调[25]。之后TianY等[26]证实NOTCH2NLC基因5’UTR区的GGC为神经元包涵体疾病（neuronalintranuclearinclusiondisease，NIID）的致病基因，最近还发现该基因GGC重复与帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）[27]、阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）[28]、肌萎缩侧索硬化（amyotrophiclateralsclerosis，ALS）[29]、多系统萎缩（multiplesystematrophy，MSA）[30]及特发性震颤（essentialtremor，ET）[31]等疾病相关。年DengJ等[32]发现眼咽远端型肌病（oculopharyngodistalmyopathy，OPDM）的另一致病基因GIPC1也为5’UTR区的GGC重复。随着基因检测技术的发展，尤其是长读长测序的应用，神经系统遗传病中关于多核苷酸重复扩增突变的研究进展突飞猛进。1.2基因Panel对于许多神经系统遗传病来说，临床表型相对复杂，而且导致这种疾病的致病基因往往不止一个，此时需要一个可以检测多个基因的Panel来提高检测结果的阳性率。基于二代测序（next-generationsequencing）平台的基因Panel适用于以下情况[4,33]：①疾病的遗传异质性较大，如HSP、CMT、PD、原发性肌张力障碍（primarytorsiondystonia，PTD）等；②临床表型相似的一组疾病，如肌病等；③临床表型相似的不同疾病，如遗传性脑白质病变，包括肾上腺脑白质营养不良（adrenoleukodystrophy）、遗传性弥漫性脑白质病变合并球状轴索（hereditarydiffuseleukoencephalopathywithneuroaxonalspheroids，HDLS）、常染色体显性遗传成人型脑白质营养不良（autosomaldominantadult-onsetdemyelinatingleukodystrophy，ADLD）、常染色体显性遗传性脑动脉病伴皮质下梗死和白质脑病（cerebralarteriopathywithsubcorticalinfarctsandleukoencephalopathy，CADASIL）等。基因Panel因为拥有较高的覆盖度、敏感性和特异性，与全外显子测序或全基因组测序相比其阳性率较高[33]。不同基因检测公司对相同一组疾病制定的基因Panel并不完全相同，一味追求全面而纳入较多与特征疾病相距甚远的基因或外显率较低的基因，最终会检测到很多意义不明确（variantofuncertainsignificance，VUS）的变异，导致基因检测报告解读更加繁琐和复杂[3]。因此，纳入检测的基因数目并非“越多越好”。譬如儿童期癫痫，含有个相关基因Panel的诊断率约为30%，其中个基因未发现任何有意义的致病突变，说明诊断率不会随着纳入基因数目增多而呈线性增长[34]。而有些基因检测公司则比较保守，只选择与特定疾病证据性较强的基因，又会导致其他相关基因的漏诊[33]。因此，选择基因Panel测序时，作为临床医生需要仔细核对基因包中是否含有与