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实用技巧特别鸣谢本文由群友Ryan提供！欢迎入群交流！一CRISPR-Cas系统简介
图1CRISPR-Cas9系统介绍
CRISPR-Cas9系统是一种被广泛运用的基因组编辑工具，它来源于细菌的适应性免疫系统。CRISPR-Cas9系统包括：Cas9酶和一个向导RNA。向导RNA作用是引导cas9到基因组的特异性位点上切割。如图1所示。目前为止，CRISPR-Cas9系统主要有两方面应用:基因敲除和基因敲入。基因敲除时,一旦DNA的双链断裂反应（DSB）被Cas9切割诱导发生,细胞会启动NHEJDNA修复方式，这会造成DNA的删除和插入。对于基因敲入，加入一个可同源重组的DNA片段,细胞会将这个一段DNA片段插入进基因组。
二两次切割介导的基因敲除与先前的敲除策略并不一样，我们改进的这个操作系统可以将基因的删除做到可控的特定长度。我们正在基因组的一个特定的区域两边各引入一个向导性RNA。这两个向导性RNA指引Cas9酶在这两个位点进行切割。然后切割后末端通过NHEJ连接上。通过这个策略，我们可以将一个基因的独立外显子或者整个基因敲除掉。如图2所示。
图2Cas9-2hitKO系统
三Cas9-2hitKO系统中涉及到的载体为了达到高效的敲除效率，我们在同一个载体重引入cas9酶和两个向导性RNA。整个系统包括3个载体：PXM，PXM和EZ-GuideXH。PXM，PXM除了含有Cas9和一个向导性RNA插入位点，还引入第二个向导性RNA插入位点。EZ-GuideXH是为插入第二个向导性RNA的辅助性载体。PXM带有EGFP荧光标记;PXM带有puromycin抗性筛选标记。
图3PXM图谱
图4PXM图谱
图5EZ-GuideXH图谱
PXM和PXM载体是从张峰实验室PXandPX载体改造过来的。主要是引入了第二个向导性RNA插入的多克隆位点。EZ-GuideXH来源于EZ-T克隆载体。
四GuideRNA的插入根据张峰实验的实验操作方法，guideRNA插入方法很简单。如图6所示，可以用BbsI消化PX载体,GuideRNA是通过引物退火方法(20bp长)引入的BbsI粘性末端通过T4DNA连接酶插入到载体中。
图6GuideRNA的插入方法
实验流程设计脱靶效应低的GuideRNA序列基于网站的GuideRNA的设计网站
