研究背景
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患者自身的T细胞通过基因工程来表达特异性T细胞受体（TCR），然后回输到患者体内，改造过的T细胞可以特异性地检测和杀死肿瘤细胞，这种治疗方法称为TCRT治疗。但TCRT治疗存在两个缺陷，一是转基因的TCR会和内源性的TCRα和β链错配或者竞争性表达，降低转基因TCR治疗效果；二是回输进体内的T细胞会产生耗竭状态，无法获得持续性的治疗效果。
CRISPR-Cas9基因编辑技术的出现和发展提高了人们基因编辑的手段和效率。在T细胞中利用CRISPR–Cas9同时靶向多个基因或可提高TCRT免疫治疗的疗效，但基因编辑位点的准确性以及编辑效率对患者的安全性具有重要影响。利用单细胞技术，可以在单个细胞水平上对基因编辑效率进行评估，并监测基因编辑后的细胞在患者体内转录组表型及其随时间的演变过程，对基因编辑免疫疗法的深入研究具有重要意义。
方法流程
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文章首先对6例患者进行T细胞分离，使用CRISPR-Cas9技术对T细胞TRAC、TRBC和PDCD1进行基因编辑，采用慢病毒转导特异性的TCR(NY-ESO-1)构建自体T细胞，对构建的T细胞进行重组TCR表达、基因编辑效率评估。
4例患者成功获得基因编辑的T细胞，其中1例患者死亡，3例患者回输了基因编辑的T细胞。利用单细胞测序技术，对基因编辑后的T细胞进行深入研究，实现了单个细胞水平的T细胞基因位点编辑准确性评估，并监测了在不同回输阶段转录组表型的变化。
研究内容
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1)CRISPR-Cas9工程T细胞（NYCE）特征
利用CRISPR-Cas9对T细胞TRAC、TRBC和PDCD1进行基因编辑，采用慢病毒转导特异性的TCR(NY-ESO-1)构建自体T细胞。研究发现NY-ESO-1TCR+T细胞占总T细胞2%~7%，利用数字PCR技术测定TRAC、TRBC和PDCD1的编辑效率分别为45%，15%和20%。
2)患者回输NYCE细胞移植效率及持久性评估
3例回输NYCE细胞的患者均无明显的不良反应，包括细胞因子综合征等。回输的NYCE细胞达到峰值后会出现持续稳定的状态，在患者血液中检测到的持久性状态维持3-9个月，细胞含量在5-50个细胞/微升，进一步利用数字PCR技术，探究了CRISPR-Cas9基因编辑细胞的扩增频率，发现TRAC和PDCD1持续存在，其频率在循环外周血单个核细胞中占5-10%，而TRBC编辑细胞的频率最低。
3)单细胞RNA测序分析揭示NYCE细胞的进化
为了更精准的探究NYCE细胞基因编辑准确性以及回输后转录表型随时间的变化，对UPN39患者治疗过程中3个时间点（0，10，天）进行了定制化单细胞转录组测序。
首先，对NY-ESO-1TCR以及TRAC、TRBC和PDCD1基因利用特异性引物，检测每个细胞4个基因特征，并对基因编辑位点附近的序列进行准确识别，可以将单细胞基因型分为野生型或突变型。结果发现TRAC存在较多的基因突变，约有30%的细胞未发现突变，约有40%的细胞有1个多位点变异。在回输10天和4个月后，UPN39细胞的单细胞基因分型显示，无论细胞是否检测到NY-ESO-1TCR，随时间的推移突变型T细胞的频率有所下降，且在回输4个月后，未检测到存在3个突变的NYCE细胞，说明突变的影响会逐渐减少。
为了进一步评估NYCE细胞随着时间的推移转录表型的变化，进行了单细胞转录组测序。发现随着时间的推移，与中央记忆相关的基因(IL7R,TCF7)的表达明显增加，而以往的研究表明，未进行基因编辑的NY-ESO-1TCR细胞主要分化为耗竭状态，说明CRISPR-Cas9基因编辑技术在维持NY-ESO-1TCR细胞免疫治疗效果具有重要作用。
4)患者临床观察结果
NYCE细胞回输后，两例患者的临床反应较好，病情稳定。截至年12月，三名肿瘤病人疾病都有所恶化，两名病人接受了其他治疗，一名病人去世。为了确定回输后NYCE细胞是否仍具有抗肿瘤活性，输注3-9个月后从患者身上获得血液样本，在NY-ESO-1肽存在的情况下进行培养，发现细胞仍具有抗原特异性细胞毒性，进一步证明了基因编辑技术应用于肿瘤免疫治疗的广阔前景。
研究结论
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这项临床I期试验首次在病人中初步证明了利用CRISPR-Cas9在T细胞中编辑多个基因进行免疫治疗的可行性和安全性，并利用单细胞测序技术，在单个细胞水平上对NYCE细胞基因编辑准确性以及回输后转录表型变化进行深入探究，展示了单细胞技术在基因编辑免疫治疗中的优势。
参考文献
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EdwardA.Stadtmaueretal.CRISPR-engineeredTcellsinpatientswithrefractorycancer.Science,.
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