外源基因在哺乳细胞中的表达及其检测
外源基因在哺乳细胞中的表达及其检测
实验目的
掌握真核细胞的培养，细胞转染以及westernblot技术检测外源基因在哺乳细胞中的表达。
实验原理
哺乳动物细胞作为宿主表达系统具有许多优点：
（1）该体系能识别和除去外源基因的内含子，剪接加工成熟的mRNA。
（2）能对翻译后的蛋白质进行加工修饰，使表达产物具有生物活性。
（3）用作受体的哺乳动物细胞易被重组DNA转染，其有遗传稳定性和可重复性。
哺乳动物基因转移载体都附有标记基因，以便于转染外源基因的细胞的筛选。外源DNA导入真核细胞的方法，常用的由磷酸钙转染法，电穿孔转染，脂质体包裹转染，显微注射及DEAE－葡聚糖转染技术。基因表达产物的检测可采用免疫荧光抗体，免疫沉淀及免疫印迹等方法进行。
实验内容
材料：质粒：pNTE-EGFP（增强型绿色荧光蛋白标签的NTE全长表达载体）pEGFP-N3（Clontech）；哺乳动物细胞COS7
试剂：细胞培养试剂：DMEM(Gibco)；胎牛血清（Hyclone）抗生素：氨苄青霉素钠盐，硫酸链霉素（Sigma）；G（Gibco）细胞转染试剂：Lipofectamine(Invitrogen)；Opti-MEMI培养基（Gibco）DNA纯化试剂盒：EndofreePlasmidMaxiKit，PlasmidMidiKit（Qiagen）Western试剂：抗体：BDLivingColorsA.v.monoclonalantibody(JL-8)(BDBiosciences,Clontech)；Anti-mouseIgG(Fcspecific)peroxidaseconjugate，Monoclonalanti-HAcloneHA-7(Sigma)；人杂交膜HybondECL（Amersham）；ECL底物：SupersignalWestPicoChemiluminescentSubstrate(Pierce)；X光片（柯达公司）
操作步骤
细胞的培养：COS7细胞在含有10%胎牛血清的DMEM，5%CO2，饱和湿度下培养。
转染用DNA的纯化：按照Qiagen试剂盒说明书进行，测定DNA的浓度和纯度。
细胞的转染：
转染前一天，接种细胞到无任何抗生素的DMEM培养基的6孔细胞培养板中，使细胞密度保持在90%饱和度。
将4mgDNA和10ml转染试剂Lipofectamine分别溶于ml无抗生素和血清的opti-MEMI培养基中，温和混匀，室温放置5分钟。
将稀释的DNA和转染试剂温和混匀，室温孵育20分钟。
将DNA和转染试剂的混合物加入到2ml无抗生素的DMEM培养基中，前后来回摇晃混匀后，37℃培养48小时，直接进行蛋白的表达检测。
检测方法一：显微观察
由于表达的基因是与绿色荧光蛋白相偶联的，因此可以在转染48h后直接在荧光显微镜下观察，如果细胞发出绿色荧光，说明外源基因在其中表达。
检测方法二：Westernblotting细胞蛋白的提取和定量
转染后的培养细胞在吸去培养基之后，用胰酶消化经离心后收集细胞。用PBS漂洗2遍后，离心收集细胞，加入一定量的细胞总蛋白裂解液（20mMMOPS，0.15MNaCl，1%NP-40，1%去氧胆酸钠，1mMEDTA，1%SDS）。在加入裂解液和蛋白酶抑制剂（1mMPMSF、10mg/mlAprotinin、2mg/mlLeupetin、2mg/mlBenzamodine）之后，充分悬浮细胞，冰上超声破碎细胞，1g离心10分钟，取上清作为细胞蛋白提取物，用Lowry法测定蛋白浓度。
蛋白质的SDS-PAGE
等量的蛋白（40mg）在加入上样缓冲液充分混匀后，沸水浴煮5分钟，瞬时离心后进行SDS-PAGE。
蛋白印迹
将电泳后的蛋白胶在转移液（3.03gTris，14.4gGlycine，mlMethanol/L）中浸泡至少20分钟；HybondECL膜在双蒸水中浸湿后，在转移液中平衡至少10分钟。半干转移法（BIO-RAD）转移3小时。
封阻和杂交
将印迹后的蛋白膜在封阻液（含5%脱脂奶粉和0.1%（V/V）Tween-20的PBS，pH7.5）中室温下封阻至少一小时。用洗液（含0.1%（V/V）Tween-20的PBS）稍洗两次后，再洗15分钟，1次；5分钟，2次。加入适量稀释的一抗，在4℃孵育杂交过夜。杂交后按照上述洗涤步骤洗膜。加入按1:稀释的二抗（偶联有辣根过氧化物酶的抗小鼠IgG抗体），在室温下孵育杂交至少1小时。按上述洗涤步骤洗膜。
化学发光曝光和显影
按10平方厘米1毫升检测液，等比例混合ECL检测液A和B，滴加在膜的蛋白面，室温放置5分钟，吸掉过多的检测液，用保鲜膜包裹膜（注意排除气泡），蛋白面朝上，黑暗下进行X光片曝光，按显影—停影—定影步骤冲洗胶片。
蛋白浓度测定（Lowry检测法）
先配制溶液A（ml含0.5gCuSO4·5H2O，1g柠檬酸）和溶液B（1L含20g碳酸钠，4g氢氧化钠）。用双蒸水稀释样品至0.5ml，然后加入2.5ml溶液C（1体积溶液A和50体积溶液B的混合物）混匀，在室温下放置5分钟-10分钟。接着加入0.25ml溶液D（等体积的Folin-酚和双蒸水的混合物），混匀。最后室温放置20分钟-30分钟后，在分光光度计上测A值。
蛋白质浓度标准曲线的制作：以牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白，0、2.5、5、10、20、40、80mg/ml的浓度蛋白制作，每个浓度设定3个重复，取平均光吸收值作为纵轴，蛋白浓度为横轴，绘制标准曲线。
