领悟功能基因研究套路之五部曲，让科研实打实的有着质的变化！
文/子非鱼
既然筛、猜二字诀已经确定了分子变量，那么这之后的规范化设计套路将在后续的36策中得到详细阐述。且自第6周始解螺旋过去一年中口碑最旺的一门课——套路课也会登台亮相，并会在四周内（每章/周）通过4章16节来全面整理一篇文章数据的全部细节。
解螺旋精心准备了6种常见科研套路课程，精通其中一二即可任意遨游5分档次的文章。考虑到功能基因研究套路是基础科研中最为初级的套路，所以本策因材施教则首先带领大家梳理下该套路中的经典模式。
功能基因就是细胞中的编码基因，涉及了DNA、RNA、蛋白三个水平。其中，蛋白是细胞的功能执行分子，而只有涉及蛋白研究机制时，才会具体到DNA/RNA的调控模式。因而这类研究本质上是聚焦蛋白的研究。
一项完整的蛋白功能研究应包含以下五个部分：
01
检测分子的基础表达。因为有表达是有功能的先决条件，而表达有差异又是功能有意义的前提。既可比较病理组织和对照组以及结合其他病理特征，来观察分子的表达情况；也可通过检测细胞模型的表达变化或者人体标本/动物模型的特定组织中的表达改变。
其中，qPCR和WB是最常用的两个检测表达差异的方法，以此可获得编码基因的mRNA和产物蛋白的表达量。一般mRNA和蛋白的表达数据是一致的，能够相互佐证；如果不一致，可能存在一些特殊的调控机制。而对于新鲜组织，还可进行石蜡切片或者免疫荧光获取蛋白细胞定位信息。
一般验证分子与表型间关系的方法有两种：Gainoffunction和Lossoffunction。而这两类实验分别应该在哪种细胞上进行操作，也可通过检测细胞表达来获取信息。常规思路则是低表达目的基因的细胞株做过表达，高表达的细胞系做基因沉默。虽然条件不满足时，可在一株细胞上既做过表达也做干扰实验，但是因为溢出效果或非特异性作用，可能会受到审稿人的质疑。
另外，表达差异分析可拓展的空间很大，如果组织样本量为80-例起步且配套详细的临床资料，那么结合疾病的其他病理特征仅做表达差异也能发SCI。具体数据格式体现为三表一图：基线资料表、单因素表、多因素表和预后生存曲线图。
02
制作过表达或者沉默的基因转导载体工具，可分为质粒和病毒两种。
就病毒而言，常见载体有3种：腺病毒（Adenovirus，Ad）、慢病毒(Lentivirus，LV)和腺相关病毒(Adeno-AssociatedVirus,AAV)，主要用于解决细胞难以转染的问题，比如原代细胞。
腺病毒主要用于基因过表达实验，而其在RNA干扰实验中的免疫源性较强，效果并不理想。
慢病毒——RNA病毒，逆转录病毒的一种，导入细胞后先逆转录成cDNA，然后整合至宿主基因组中进行表达，既可做RNAi实验，也可做CRISPR实验，适合插入短的基因表达片段。不同的基因包装效率也有不同，有时候基因不大但出毒效率也低。
由于整合后的基因本身不稳定又或者启动细胞代偿机制，长期培养的细胞株仍会存在表达的基因丢失或者沉默效率减弱的情况。所以要通过分选感染成功的单克隆细胞再扩增，或用抗性基因进行压力筛选，来获取细胞稳转株。
腺相关病毒不仅可做过表达也可做干扰实验，效率都还不错。该病毒存有不同血清型，且对不同细胞的感染效率不一样，因而具有特异性。总之，选择载体要根据实验情况来具体斟酌，最可靠的是通过预实验来判断相应的载体工具。
此外，在正式开始表型实验之前，还应该对基因操作的效率进行验证，只有提供了过表达或者沉默有效的证据，工具才算制备成功。
03
细胞水平实验。每一种特定的疾病和表型参数组合下都有固定的模、法、标的套路，涉及表型的实验往往是很常见的。而论证一个表型一般是采用多个不同原理的实验反复佐证，即同一个实验不同细胞做，同一个细胞做不同实验验证。
04
体内动物实验。虽然有时同一个表型的细胞和动物水平结果会出现在一个Figure上，但大家应该学会在论文大致框架不动的情况下，将每篇文章的数据归属于哪里自动归位，从而掌握泛读文献的精髓。
05
回复实验（Rescue）。通常一项功能基因研究中完成以上四步就可以发文章，但要形成逻辑严密的论证，就需要进行Rescue实验，即在同一个条件下先正向再反向或者先反向再正向观察表型的得而复失或者失而复得，以此排除现象背后的假阳性本质，降低主观性影响，建立可靠的因果逻辑。
在单变量论证里，Rescue实验通常的做法是先把基因用siRNA沉默掉，然后把稳定沉默这个基因的细胞再分成两组，一组转对照，另一组转入过表达载体，然后观察表型变化。只有当过表达后能够把原来沉默失去的表型回复回来的情况下，才证明该表型是依赖于这个分子存在而存在的，两者具有因果效应。
综上，本策因材施教针对基因功能研究介绍了一套5个步骤的研究套路——12个字诀：表达差异、正反回复、细胞动物。理解了这个数据框架，就能够开始收获文章的果实了，新基因老表型或者老基因新表型都是可以发文章的。而下一讲第10策，举一反三，则会教给大家一些分子修饰的常识，拓展对分子这个变量变化的认识。敬请期待。
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