一、研究背景1.颅骨锁骨发育不全综合症（CCD）是一种先天性骨骼系统的发育畸形，常为遗传性发育障碍。表现为身材矮小，面部和锁骨发育不全以及颅缝闭合延迟。研究表明有60%的CCD病人“RUNX2”位点发生基因突变，RUNX2（corebindingfactoralphal1,核心结合因子a1）是控制成骨细胞的特殊转录因子。然而，还有40%的CCD的病人并没有发生该位点的突变，这意味着其他的突变基因可能会导致这种疾病。
2.成骨一般有两种方式：intramembranousossification（膜内成骨）和endochondralossification（软骨内成骨）两种。软骨内成骨：是指在预先形成的软骨雏形的基础上,使软骨逐步被替换为骨。脊椎、骨盆、肢体骨的形成采用此种方式。膜内成骨：这种方式是先由间充质分化成为胚性结缔组织膜，然后在此膜内成骨。人体的顶骨、额骨和锁骨等即以此种方式发生。膜内成骨的具体的过程是：在将要形成骨的部位，血管增生，营养及氧供丰富；间充质细胞逐渐密集并分裂分化为骨原细胞，其中部分骨原细胞增大，成为成骨细胞；成骨细胞分泌类骨质，并被包埋其中，成为骨细胞；继而类骨质钙化成骨基质，形成最早出现的骨组织。新形成的骨组织表面始终有成骨细胞或骨原细胞附着，它们向周围成骨，逐渐形成初级骨小梁构成初级骨松质。
研究发现，由于RUNX2功能障碍引起膜内成骨的破坏，从而导致颅骨锁骨发育不全综合症。作者提出假设:可能RUNX2的失调激活了信号通路可能引起CCD
3.RUNX2和TAZ（转录共活化因子）是成骨细胞发育过程中非常重要的转录因子，但TAZ如何调控成骨的机制目前暂时不明确。
4.已有研究表明，端锚聚合酶(tankyrases）能够催化PAR(ADP核糖聚合物)转移至Axin的残基上,导致Axin的PAR核糖基化。泛素连接酶RNF能够通过自身的PAR结合域与PAR核糖基化的Axin结合,发挥其泛素化连接酶的作用,降解Axin,促进Wnt信号通路。而Wnt/β-catenin信号通路在胚胎时期的成骨细胞分化、骨骼的形成过程中至关重要。
泛素化具体过程：泛素化修饰涉及泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3的一系列反应:首先在ATP供能的情况下酶E1粘附在泛素分子尾部的Cys残基上激活泛素,接着,E1将激活的泛素分子转移到E2酶上,随后,E2酶和一些种类不同的E3酶共同识别靶蛋白,对其进行泛素化修饰。泛素化在蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用
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二、研究结果
Fig1、RNF基因缺乏的小鼠出现类颅骨锁骨发育不全综合症的表现（1）作者想要研究RNF基因在小鼠胚胎期的成骨作用。作者首先构建了Rnffl/flCMV-Cre小鼠模型，即把小鼠所有系统中的RNF基因敲除，结果出现了胚胎致死的现象。作者对15.5周的胚胎小鼠进行了茜素红和阿尔新蓝染色，观察到RNF基因敲除小鼠的颅骨中成骨形成明显减少（fig1A）。（2）由于胚胎致死，作者接下来构建了Rnffl/flOsx-Cre小鼠模型，即在胚胎小鼠成骨系中进行条件性敲除RNF基因。这些小鼠在出生不久后由于呼吸衰竭而死亡，作者通过茜素红和阿尔新蓝染色和μCT观察到，与对照组相比，Rnffl/flOsx-Cre小鼠身材矮小，前后囟门扩大，颅骨骨量减少（fig1B、C、D）。（3）同时，作者发现在其他骨骼结构中，包括锁骨、上下肢体骨，均出现了骨骼的发育不全，骨量减少（fig1E、F、G）。（4）茜素红染色发现Rnffl/flOsx-Cre小鼠的颅骨的矿化减少（fig1H）。（5）HE染色发现Rnffl/flOsx-Cre小鼠的下颌切牙显示出牙周牙槽骨和牙釉质发育不全，成釉细胞排列紊乱，极化消失（fig1I）。（6）利用原位杂交技术（Insituhybridization，ISH）检测成骨相关蛋白nogginandsonichedgehog（SHH），发现这两个蛋白表达和对照组没有差异（fig1J）。原位杂交技术（Insituhybridization，ISH）的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来（7）HE染色发现，Rnffl/flOsx-Cre小鼠的胫骨骨小梁体积减少65%（fig1K、L）,然而番红O染色（fig1M）、ISH检测CoL2a1、Col10a1（fig1N、O）发现与对照组均无明显差异，这表明Rnffl/flOsx-Cre小鼠软骨细胞分化正常。以上结果表明，RNF基因在小鼠胚胎期骨骼发育中至关重要，它可能通过膜内成骨和软骨内成骨两种方式参与小鼠胚胎期的骨骼发育。
Fig2、成年后敲除RNF基因的小鼠由于成骨缺陷，在出生后出现骨量减少。（1）接下来作者想要探究RNF基因在出生后成年小鼠中的作用。利用四环素诱导条件性基因敲除系统，得到Rnffl/flOsx-Cre(KO)小鼠。通过μCT发现，与对照组Rnffl/fl(WT)相比，KO小鼠骨小梁骨量、矿化密度、数量明显下降。（fig2A、B、C、D），骨小梁间距相对增加（fig2E），同时发现皮质骨骨量、厚度相对下降（fig2F、G）。（2）利用Goldner三色染色发现，与对照组Rnffl/fl(WT)相比，KO小鼠骨小梁明显减少（figH），类骨质表面积、成骨细胞表面积明显下降（figI、J）。Goldner三色染色又称戈德纳三色染色，矿化骨--绿色，类骨质--橙红色，软骨--紫色，细胞核--蓝灰色（3）利用钙黄绿素标记进行骨组织形态记量学统计，与对照组Rnffl/fl(WT)相比，KO小鼠骨形成率、矿化沉积率、矿化表面积均有明显下降（figK、L、M）。（4）利用TRAP染色发现，KO小鼠胫骨的破骨细胞表面积、破骨细胞数量与对照组Rnffl/fl(WT)相比均无明显差异（figN、O）。以上结果表明，RNF基因敲除小鼠的骨量减少是由成骨细胞介导的骨形成缺陷导致的结果。
Fig3、RNF基因在成骨细胞分化中至关重要。（1）利用Rnffl/fl(WT)小鼠的颅盖骨提取原代成骨细胞进行分化培养，发现RNF的转录和蛋白水平在7、14天均有明显增加（fig3A、B）。（2）为了探究RNF基因在成骨细胞分化中的分子机制，作者进行了腺病毒感染消除RNF基因。结果发现，与对照组GFP相比，实验组Cre的成骨细胞（RNF-nullosteoblast）的成骨矿化能力下降，以及与成骨相关的Col1a1、Alp、Osteocalcin的RNA水平降低（figC-F）。（3）接下来作者通过WB检测发现，实验组Cre的成骨细胞（RNF-nullosteoblast）在WNT3a的诱导下，AXIN1蛋白表达明显上升，而活化的β-catenin蛋白表达下降（fig3G、H）。（4）由于RUNX2蛋白在WT和RNF-null的成骨细胞中表达无差异（SP3D），于是作者检测了与RUNX2共同促进成骨基因转录的TAZ蛋白的表达水平。发现与对照组相比，实验组Cre的成骨细胞（RNF-nullosteoblast）在WNT3a的诱导下，TAZ蛋白水平明显下降（fig3I）。
Fig4、RNF基因通过FGF18-TAZ调节成骨细胞分化之前的研究报道Fgf18是β-catenin的靶基因，而且Fgf18基因敲除小鼠具有CCD表型，于是作者猜测Fgf18基因可能参与了成骨细胞分化的调控。FGF18是FGF（成纤维细胞生长因子）家族的一员，在细胞的形态发生、血管生成中扮演着重要的角色。（1）首先作者发现，实验组Cre的成骨细胞（RNF-nullosteoblast）在WNT3a的诱导下，Fgf18转录水平明显下降（fig4A），而且在成骨诱导的前三天中检测到Fgf18转录水平也下降（fig4B）。（2）接着作者通过启动子试验检测发现Fgf18增加了RUNX2介导的骨钙蛋白启动子的活性（fig4C），同时发现在颅盖骨来源的成骨细胞和成肌细胞（C2C12）中，Fgf18增加了TAZ的转录和蛋白水平的表达（fig4D、E）。以上结果表明，Fgf18可能调节TAZ的表达。（3）接着作者通过启动子试验检测发现在成肌细胞（C2C12）中，由于TAZ的沉默导致Fgf18诱导的骨钙蛋白启动子的活性下降（fig4F）。同时作者发现，沉默Fgf18导致TAZ的表达下降（fig4G）。以上结果表明，FGF18通过调节TAZ的表达调控骨钙蛋白的表达和成骨分化。（4）接着作者发现外源性加入FGF18能够挽救RNF-null成骨细胞的矿化能力（fig4H），同时作者发现使用U（一种ERK的抑制剂）能够抑制FGF18对TAZ的表达，也能够抑制RUNX2-TAZ介导的骨钙蛋白启动子的活性（fig4I-K）。以上结果表明，FGF18通过调节TAZ的表达调控成骨分化，成骨细胞的矿化能力可能通过FGF18-MAPK-TAZ信号通路。
Fig5、RNF基因在成骨细胞增殖中至关重要。（1）RNF-null成骨细胞除了成骨矿化能力减弱，其增殖能力也有一定减弱（fig5A）（2）之前有报道，TAZ和TEAD通过诱导下游靶基因CTGF调节细胞增殖。作者发现，在C2C12中，FGF18能够诱导CTGF的表达，而沉默TAZ能够减弱FGF18对CTGF的表达（fig5B）。同时作者发现FGF18能够促进C2C12增殖，而沉默TAZ能够减弱FGF18对C2C12的增殖（fig5C）。（3）作者还发现FGF18能够促进颅盖骨来源的成骨细胞的增殖，而沉默TAZ能够减弱FGF18对细胞的增殖作用（fig5D、E）。以上结果表明，RNF基因通过FGF18-TAZ信号通路参与成骨细胞的增殖作用。（4）最后，作者通过检测Rnffl/fl(WT)和Rnffl/flOsx-Cre(KO)小鼠颅骨的相关基因发现，KO小鼠的Rnf以及β-catenin的下游基因Axin1,cyclinD1,Fgf18的转录水平均下降（fig5F-I）。此外，作者发现KO小鼠的TAZ、OSX、骨钙蛋白水平也明显下降，而RUNX2水平无统计学差异（fig5J-M）。以上体内结果与fig3、4的体外结果相符合。上述结果表明，RNF基因通过调控FG18-MAPK-TAZ信号通路参与调控成骨细胞的分化与增值，从而调控胚胎期和出生后的骨形成过程。
Fig6、RNF基因抑制脂肪细胞发育和脂肪储存（1）在fig3C的研究过程中，作者注意到RNF-null成骨细胞的祖细胞在成骨培养基分化成脂肪细胞而不是成熟的成骨细胞（SupplementalFigure6A）。而且成脂的相关蛋白Pparg2、Fabp4的表达上升（SupplementalFigure6B、C）。（2）接下来作者用RNF基因敲除小鼠的胚胎成纤维细胞（MEFs）进行成脂培养，通过油红O染色发现Rnffl/flCMV-Cre(KO)组的成脂分化明显增加（fig6A），同时与成脂相关的蛋白和转录因子PPARγ、FABP4的表达升高（fig6B-D）。以上结果表明，RNF可能抑制细胞成脂分化。（3）之前研究表明，Wnt/β-catenin信号通路通过抑制PPARγ的表达抑制细胞成脂分化。作者发现RNF基因能够通过稳定AXIN1的泛素化从而激活WNT3a介导的β-catenin的活性（fig6B、E）。此外，作者利用GSK-3β抑制剂LiCl发现能够逆转RNF-deficient促进成脂分化的能力（fig6F）。同时作者也通过异位表达β-catenin（S33Y）发现能够抑制RNF-deficient促进成脂分化的能力（fig6G）。（4）与此同时，作者对Rnffl/fl(WT)和Rnffl/flOsx-Cre(KO)小鼠的胫骨进行了HE染色，发现KO小鼠的胫骨有明显的脂肪堆积。具体定量统计，KO小鼠胫骨骨髓脂肪储存增加了40倍，脂肪垫重量增加了2倍（fig6H-J）。以上结果表明，RNF基因通过Wnt/β-catenin信号通路抑制脂肪细胞分化同时促进成骨细胞分化。
Fig7、RNF基因敲除小鼠具有糖代谢缺陷骨钙蛋白是由成骨细胞通过对RUNX2-TAZ转录复合物的调控合成和分泌的维生素K依赖性钙结合蛋白。骨钙蛋白有2种存在形式即羧化不全骨钙蛋白和羧化骨钙蛋白。研究发现，羧化不全骨钙蛋白能够增加胰岛素的分泌和敏感性。作者发现RNF能够促进骨钙蛋白启动子活性（fig4C），提示RNF和葡萄糖在体内平衡存在潜在的联系。（1）作者用ELISA检测六个月大小的小鼠的血清，发现与对照组Rnffl/fl(WT)相比，KO小鼠的羧化不全骨钙蛋白表达量下降（fig7A），同时发现骨钙蛋白的靶基因脂肪连接蛋白表达水平也下降（fig7B）。（2）作者还检测了小鼠的甘油三酯和血清葡萄糖水平，发现KO小鼠体内的甘油三酯和血糖水平均有上升（fig7C、D）。（3）作者还做了糖耐量试验和胰岛素分泌试验，发现与对照组WT相比，KO小鼠糖耐量受损，胰岛素分泌减少（figE、F）。以上结果表明，在小鼠体内缺少RNF基因将导致糖耐量受损。（4）作者通过HE和免疫组化，发现与对照组WT相比，KO小鼠胰腺中胰岛细胞数量和大小都下降（figG）。（5）最后，作者进行了一个挽救试验，对KO小鼠腹腔注射葡萄糖和人重组羧化不全骨钙蛋白，发现注射骨钙蛋白后小鼠血糖有所下降（figH）。以上结果表明，RNF基因敲除小鼠糖代谢受损与骨钙蛋白分泌不足有关。三、总结（1）RNF基因缺乏的小鼠出现类颅骨锁骨发育不全综合症的表现该团队还在年11月的JCI发表上一篇文章，发现Hippo通路转录辅激活剂TAZ被非受体酪氨酸激酶ABL稳定和激活后，通过激活转录因子TEAD和RUNX2促进成骨细胞增殖、分化、矿化。MatsumotoY,etal.ReciprocalstabilizationofABLandTAZregulatesosteoblastogenesisthroughtranscriptionfactorRUNX2.JClinInvest.;(12):–.
而这篇文章向我们展示了另一种TAZ调节通路，即RNF---Wnt/β-catenin---FGF18---MAPK---TAZ。RNF的缺失揭示了FGF18--TAZ通路在一种人类遗传性疾病颅骨锁骨发育不全综合症综合征中表现的重要性。
（2）泛素化连接酶RNF调节骨的动态平衡该团对在年3月的JCI发表上一篇文章，发现RANKL通过NF-KB抑制RNF的泛素化，之后通过下游的3BP2--SRC和WNT--AXIN--β-catenin信号通路促进破骨细胞分化。MatsumotoY,etal.RANKLcoordinatesmultipleosteoclastogenicpathwaysbyregulatingexpressionofubiquitinligaseRNF.JClinInvest.;(4):–.
而这篇文章向我们展现了RNF基因在成骨细胞增殖、分化中的重要性。这也为接下来探究RNF基因在成破骨信号通路网络的研究打下了一个基础。
（3）RNF基因通过Wnt/β-catenin信号通路抑制脂肪细胞分化同时促进成骨细胞分化。
（4）RNF参与能量代谢的调节。
通过该团队的研究，结合临床上的CCD病人，这些病人可能存在骨量下降、糖耐量受损、代谢综合征的风险，而这可能与RNF基因有关。
参考文献（对话框内回复“JC62”下载原文）：
1MatsumotoY,LaRoseJ,LimMetal.UbiquitinligaseRNFcoordinatesbonedynamicsandenergymetabolism.JClinInvest;:-.
