CRISPR火了这么久，到底是怎么一回事？有啥用？怎么工作的？今天我们就一起来看看。
CRISPR、CRISPR/Cas、CRISPR/Cas9CRISPR：英文全称是ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，规律成簇的间隔短回文重复，是大多数细菌及古细菌中一种不断进化适应的免疫防御机制。
CRISPR/Cas：英文全称是Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated（Cas）systems，是原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。
CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰（RNAi）的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。
CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。现在使用的CRISPR/cas9系统是由最简单的typeIICRISPR改造而来，该系统由单链的guideRNA和有核酸内切酶活性的Cas9蛋白构成。其机理如下图所示。
CRISPR发现历史在年的一篇论文中，日本大阪大学的研究人员报告了一项表面上微不足道的研究发现。他们在调查一种编码碱性磷酸酶的细菌基因序列时，发现了邻近的一个不同寻常的DNA片段，这一DNA片段中间是一段短直接重复核苷酸序列，两侧为短特异片段。他们当时指出这些序列的生物学意义尚不清楚。
这个还是从我们最熟悉的E.coli，最经典的K-12株系中发现的，与CRISPR沾边的，就是这个回文序列。这个发现纯属偶然，也没有引起包括发现者本身太大的重视，甚至这种特征序列都没有一个名字。
直到年，研究人员通过计算机操作发现很多原核生物（真细菌和古细菌），都有类似被21-37bp的回文重复序列间隔开的非重复序列后，他才正式有了这个顾名思义的名字CRISPR，成簇的、规律间隔的、短回文、重复序列并且除了这样的特征序列外，在他们的附近还有一些CRISPR-associated基因，也就是我们后来说的发挥大刀剪切作用和整合外源片段作用的一系列Cas蛋白。
于是我们基本可以得到这样一张漂亮的模式图，并清楚了CRISPR系统中最重要的三大元件—spacer（白色方块），回文repeats（双三角），cas等基因。
年2月15日发表在《科学》（Science）的两篇文章，证明Cas9系统能在T，K，iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组（NHEJ）、同源重组（HR）效率在3-25%之间，与TALEN酶切效果相当。文章还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。
曾构建第一只转基因小鼠的RudolfJaenisch教授采用CRISPR/Cas技术成功构建了同时携带多个基因突变的小鼠。CRISPR/Cas技术构建基因敲出小鼠的效率非常高，且可绕开胚胎干细胞操作过程。该技术重新定义了模式动物。
CRISPR如何工作阶段1：外源DNA采集
外源核苷酸是通过Cas蛋白识别，入侵的短片段DNA（30-50个碱基对）被称为protospacers，作为间隔序列插入宿主CRISPR位点中，由重复序列隔开。
对于I型和II型系统来说，protospacers来自入侵DNA中两侧出现2-5个核酸结构（PAM，protospaceradjacentmotif）的区域。
一般protospacers连接在CRISPR位点的一端，并且后者通过涉及Cas1、Cas2和游离3’-hydroxyls等元件的机制，牵引序列。Protospacer的整合过程中也出现了牵引末端重新序列复制，这可能涉及宿主聚合酶和DNA修复机制。
阶段2：crRNA合成
CRISPRRNA在转录之后，生成初级转录产物：pre-crRNA，之后经过加工，又成为一组短小的CRISPR衍生RNAs（crRNAs），这些crRNAs每一个都包含有对应于之前遇到的外源DNA的对应序列。
阶段3：靶向干扰
成熟的crRNAs能指导Cas蛋白靶向互补靶标，靶标序列由专用Cas核酸酶降解，但其靶标降解的机制存在差异。I型和II型系统都可以靶向包含PAM和protospacer互补序列的dsDNA底物。
用一张图来表示就是下面这样：
参考文献
RNA-GuidedHumanGenomeEngineeringviaCas9Science.Feb():-6.
MultiplexGenomeEngineeringUsingCRISPR/CasSystemsScience.Feb():-23.
One-StepGenerationofMiceCarryingMutationsinMultipleGenesbyCRISPRCas-MediatedGenomeEngineering.Cell,Volume,Issue4,-.
MoSnapShot:CRISPR-RNA-GuidedAdaptiveImmuneSystems,Cell.
作者：霸霸
配图来源：网络
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