基因工程的操作流程
1、分：分离目的基因
2、切：对目的基因和载体适当切割
3、接：目的基因与载体连接
4、转：重组DNA转入受体细胞
5、筛：筛选出含有重组体的受体细胞
6、表：目的基因在受体细胞中表达，受体细胞成长为基因改造生物
基因工程制药的基本过程
l获得目的基因↓构建重组质粒↓组建基因工程菌或者基因工程细胞↓工程菌培养↓产物分离纯化↓基因工程药物的质量控制
载体概述
什么是载体？
l载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。
质粒载体
三个显著特点：
（1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含-个拷贝）。
（2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ′，可利用a-互补原理进行蓝白斑筛选。
（3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。
外源蛋白质检测
l利用插入DNA所表达的蛋白质的功能或者结构性质，检测外源蛋白质的存在。适用于表达载体的检测。
受体细胞选择
l外源基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌细胞中的表达
l外源基因在病毒中的表达
l外源基因在酵母细胞中的表达
l外源基因在昆虫细胞中的表达
l外源基因在植物细胞中的表达
l外源基因在哺乳动物细胞中的表达
l1、大肠杆菌表达系统
l大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。
l优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。
l缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原反应。
l2、枯草杆菌表达系统
l枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。
l优点：
l枯草杆菌具有胞外酶分泌－调节基因，能将具有表达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。
l枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌。
l枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。
l枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。
l应用：已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。
包涵体表达
l在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹或无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（InclusionBodies，IB）。
l如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长处所在。
l在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作。
融合型表达
l将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达,由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。
l在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白。
N末端：由原核基因编码一段多肽，
C末端：是完整的真核外源基因。
（D3）受体蛋白的切除方法
l化学断裂法：溴化氰（CNBr）--Met-（切点）-AA
l酶促断裂法：凝血因子Xa，有蛋白酶活性，识别序列:Ile－Glu－Gly－Arg-（切点）-AA
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