Nature
小分子抑制剂BI-可诱导BCL6快速泛素化和降解
年11月18日，Nature杂志在线发表了丹娜-法伯癌症研究所(Dana-FarberCancerInstitute)EricS.Fisch及BenjaminL.Ebert教授课题组的最新研究成果：Small-molecule-inducedpolymerizationtriggersdegradationofBCL6，该研究发现小分子药物BI-可诱导BCL6有序聚集之后发生快速泛素化和降解，提出了小分子药物通过诱导聚合及随后的特异降解来使靶蛋白失活的蛋白靶向降解新机制，为新型蛋白降解剂的开发提供了新方向。
研究背景
小分子诱导的蛋白质降解已逐渐成为一种重要治疗策略，分子胶和PROTACs等蛋白降解剂已显示出对靶蛋白的持续降解及显著临床活性，但仍有部分蛋白并不适用于目前已有的降解机制。BCL6被认为是非霍奇金淋巴瘤，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和滤泡型淋巴瘤药物治疗的重要潜在靶标。在淋巴瘤细胞中敲除BCL6会导致肿瘤停滞，目前已有数种靶向BCL6的肽和小分子抑制剂在体内显示了疗效，但仅在高浓度下才有效，限制了它们转化为临床治疗药物。
新型BCL6抑制剂筛选鉴定出小分子如BI-(来源于文章ChemicallyInducedDegradationoftheOncogenicTranscriptionFactorBCL6)，这些小分子出乎意料地诱导了BCL6的降解。此前已发现小分子BI-可以与BCL6的BTB结构域结合，诱导BCL6降解，BI-处理可诱导BCL6快速泛素化降解，对DLBCL细胞系的抗增殖活性与基因敲除相当，远优于其他抑制剂或降解剂。因此，详细探索BI-诱导BCL6降解的分子机制对推进BCL6降解剂的临床研究具有重要意义。
主要发现
1.BI-诱导BCL6特异性降解
BI-可诱导BCL6降解，那么BI-是否仅能诱导BCL6降解？BCL6是否可被其他BI-类似物诱导降解？作者在SuDHL4(DLBCL衍生的细胞系)中进行了基于定量质谱的蛋白质组学鉴定发现，BCL6是唯一用BI-处理后丰度明显降低的蛋白(图1a)，使用与BI-结构相似的BCL6抑制剂BI-处理不会改变任何蛋白的丰度(图1b,c)。上述研究表明，BI-诱导BCL6特异性降解。
Fig1.BI-inducesspecificdegradationofBCL6
2.BCL6(1–)是介导药物诱导降解的关键区域
BI-可以诱导BCL6特异性降解，那么其诱导BCL6降解的关键是什么？作者通过HEKT细胞中报告基因检测发现，BI-诱导的BCL6降解可被蛋白酶体抑制剂MG及泛素激活酶UBA1抑制剂MLN削弱，但neddylation途径抑制剂MLN对其无影响(图2a,b)，提示BI-诱导的BCL6降解为泛素化降解。作者通过表达不同截短型的BCL6蛋白发现，当BCL6蛋白含有N端前个氨基酸(包括与药物结合的BTB结构域)时，BI-方可诱导BCL6降解(图2c)。
Fig2.ToidentifythecriticalregionofBCL6thatmediatesdrug-induceddegradation
3.BI-可诱导BCL6在胞内聚焦
BI-诱导的BCL6降解会对细胞产生何种影响？作者采用活细胞荧光显微镜检查eGFP-BCL6在胞内的定位，发现BI-处理HEKT细胞，短时间内可观察到eGFP聚集点信号，随着处理时间的延长，信号逐渐消失(图3a)，这与BI-介导BCL6降解的过程一致。SuDHL4细胞中也观察到同样的信号变化(图3b)。那么，eGFP聚集点信号的产生与BI-/BCL6相互作用直接相关吗？作者构建了含BTB结构域但不能发生降解的BCL6蛋白(eGFP–BCL6(1-))，结果显示含有eGFP–BCL6(1-)的细胞经BI-处理也可形成eGFP聚集点，但信号不随处理时间的延长而改变。外源添加过量的BI-，可使得eGFP聚集点信号消失(图3c)，提示BCL6在胞内的聚集与BI-/BCL6相互作用直接相关，且该聚集可被竞争性小分子解除。
Fig3.BI-inducescellularBCL6foci
4.BCL6在BI-作用下可形成螺旋形结构
BCL6为何会在胞内聚集？作者使用纯化的BCL6蛋白发现，BI-而非BI-的存在可导致BCL6分子量比未经药物处理的分子量更高(图4a)。负染电镜结果显示无BI-孵育情况下，BCL6以单分散颗粒形式存在。将BCL6与BI-孵育后，可观察到正弦形规则结构的形成(图4b)。建模计算结果显示仅当两个BCL6二聚体与两个BI-分子在界面处对称缔合方可产生螺旋形的超结构(图4c,d)。作者通过冷冻电镜获得了BI-诱导的BCL6细丝结构，冷冻电镜结构与建模数据一致，螺旋丝分布均匀(图4e)，但该螺旋结构不是固定的，能够灵活变化(图4f)。
Fig4.ThemolecularbasisoftheformationofBCL6foci
5.BI-诱导BCL6聚合
BI-如何影响BCL6细丝的形成和降解？作者获得了分辨率为3.7?的BCL6细丝冷冻电镜结构(图5a)。发现BI-在BCL6二聚体之间的凹槽处直接与BTBα亚基的Tyr58结合，此外，BI-还通过与相邻BCL6二聚体(BCL6γ/δ)上的Cys84发生疏水相互作用促进BCL6进一步组装。除了BI-与不同BCL6二聚体间的相互作用外，BTBβ的Arg28和BTBγ亚基的Glu41形成的分子间相互作用也是维持BCL6细丝结构的关键作用力(图5b)。而将冷冻电镜结构中的BI-置换为结构相似的BCL6抑制剂BI-后，模型结果显示BI-突出的甲酰胺基部分会与相邻BCL6二聚体存在空间冲突(图5c)，从结构式上解释了BI-不能诱导BCL6聚合反而导致BCL6降解的原因。
Fig5.BI-inducesthepolymerizationofBCL6
6.BCL6聚合是BCL6胞聚产生的必要条件
BCL6聚合与产生的BCL6胞聚有什么联系？作者引入并分析了削弱药物结合或者BCL6二聚体-二聚体相互作用的突变，发现将BCL6中的Tyr58残基突变为丙氨酸可在体外阻止与BI-的结合(图6a)，因此阻止了BCL6在胞内的聚集。Arg28和Glu41可形成一个盐桥，这对于BCL6二聚体-二聚体的相互作用至关重要，同样将这两个氨基酸任一残基突变为丙氨酸(R28A或E41A)都可以防止BI-处理后病变的产生。Cys84与相邻的BI-分子的甲基形成疏水相互作用，所以C84A突变也显着减少了细胞病变的产生(图6b)。那么，在BCL6蛋白中引入突变，破坏BCL6二聚体与二聚体间的相互作用是否会影响BCL6的胞内聚焦呢？作者对BCL6BTB结构域(残基32–99)内的氨基酸残基逐一进行丙氨酸突变，并测试了每个突变蛋白对SuDHL4淋巴瘤细胞中BI-细胞毒性的影响(图6c)，及BI-诱导的HEKT细胞中BCL6报告基因的降解(图6d)，发现位于BI-结合位点附近的G55A，Y58A及BCL6聚合作用界面的E41A，C84A四个突变体对BI-的活性影响较大(图6e)，且上述四个突变体在依赖BCL6的SuDHL4和Raji细胞系中的过表达可导致细胞对BI-产生抗性，但对BCL6非依赖的DEL细胞系则无影响(图6f)。上述结果表明BI-可诱导BCL6聚集，破坏BCL6二聚体相互作用阻断药物诱导的BCL6聚合，阻止细胞中BCL6聚集、BCL6降解和BI-细胞活性。
Fig6.MutationoftheaminoacidsinBCL6thatarecriticalfordimer-dimerinteractionsdisruptsdrug-inducedpolymerization.
7.SIAH1介导了BI-诱导的BCL6降解
那么BI-在胞内如何诱导BCL6降解呢？作者通过筛选发现BI-处理可导致cullinE3泛素连接酶SIAH1表达异常(图7a)。那么SIAH1是否与BI-诱导的BCL6降解及BI-抗性产生直接相关呢？作者发现胞内导入靶向SIAH1的sgRNA可减弱BI-诱导的BCL6降解(图7b)。野生型SIAH1的过表达不仅增强了BI-依赖性的BCL6降解，在不存在BI-的情况下也可降低BCL6丰度(图7c)，提示SIAH1在药物依赖性和内源性BCL6降解中均有作用。此外SIAH1E3连接酶识别底物蛋白上的VxP基序，该基序存在于BCL6蛋白的-残基(图7d)，提示仅含有VxP肽(BCL6(-))与BCL6BTB结构域(BCL6(1-))即可使得SIAH1介导BI-诱导BCL6降解，且降解作用会因BCL6VxP基序突变(VSPGSA)而减弱(图7e)。
Fig7.ValidatetheroleofSIAH1indrug-inducedBCL6degradation
8.BCL6聚合可增强SIAH1相互作用和泛素化
SIAH1E3连接酶通过识别底物蛋白上的VxP基序介导BI-诱导BCL6降解，那么VxP基序是否为SIAH1诱导BCL6降解所必须？作者通过实验发现VxP基序的缺失或突变可阻断BI-诱导的BCL6降解(图8a)，仅含VxP的肽(BCL6(–))足以实现与SIAH1的相互作用(图8b,c)，重组蛋白的体外泛素化实验表明，BCL6是SIAH1的底物，BI-促进了BCL6泛素化的速率和程度(图8d)。那么BI-诱导的BCL6聚合如何影响SIAH1介导的BCL6降解呢？作者发现BCL6和SIAH1间具有一定的亲和力，BI-诱导BCL6聚合后，该亲和力大大增强(图8e)，尽管BI-和BI-对BCL6的结合能力相似，但BI-并不影响BCL6与SIAH1之间的相互作用(图8f)，提示BI-诱导的聚合反应增强了BCL6和SIAH1之间的相互作用，使得BCL6的泛素化和降解加速。
Fig8.BCL6polymerizationenhancesSIAH1interactionandubiquitination
总结
本篇论文研究发现BI-与BCL6蛋白BTB区域结合后可诱导进行高度有序聚集，BCL6的有序聚集可增强BCL6和E3连接酶SIAH1间的相互作用，并促进BCL6泛素化及降解。与其他BCL6抑制剂相比，BI-通过特异性诱导BCL6有序聚集及特异性降解，提高了BI-对BCL6胞内抑制活性，为靶向药物的开发提供了新途径。
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