摘要：
以前的报告已经在全身性癫痫患者中发现了SLC6A1变异体，例如肌阵挛无张力癫痫和儿童失神癫痫。然而，到目前为止，尚没有一种已确定的SLC6A1变体被用于测试对GAT-1转运蛋白活性的影响。本研究的目的是确定SLC6A1变异体在例随机选择的癫痫患者中的发生率，并评估已识别的变异体对γ-氨基丁酸转运的影响。靶向重测序用于筛查名随机选择的癫痫患者的SLC6A1变异。共鉴定出5个错义变异、1个框架内缺失、1个无义变异和1个内含子剪接位点变异，诊断率为1.7%。利用[3H]-GABA转运实验，发现7个已鉴定的外显子变异体降低了GABA的转运活性。微基因剪接分析显示，剪接位点变异破坏了mRNA转录本中外显子9的规范剪接，导致蛋白质过早截断。这些发现表明，SLC6A1是导致儿童癫痫的重要原因，而引起癫痫的SLC6A1变异的常见结果是GAT-1功能的下降。
引言：
SLC6A1编码钠氯偶联的γ-氨基丁酸转运体GAT-1，负责从突触重新摄取抑制性神经递质γ-氨基丁酸。以前的报道证实，在肌阵挛无张力癫痫(也称为肌阵挛无张力癫痫或Doose综合征)和其他全身性癫痫患者中，SLC6A1杂合变体很可能是功能丧失的。虽然已经假设SLC6A1癫痫突变很可能是功能丧失的，但这些报道的变体对功能的影响尚未通过实验确定。在这项研究中，我们报告了从例癫痫患者中鉴定出的8个SLC6A1变异体，这些患者未经选择进行基因测试。通过剪接和GABA转运分析，我们证明了这些变体降低或取消了GAT-1GABA转运蛋白的功能。
方法：
1.新一代测序和Sanger确认
新一代测序和Sanger确认按照先前发表的那样进行。7简单地说，来自名癫痫患者的DNA样本接受了大约个与人类疾病相关的基因的有针对性的重新测序。使用NextGENe(SoftGenetics，宾夕法尼亚州州立学院)在编码外显子内调用变体，并将±10bp调用到内含子中。使用基因组聚合数据库筛选变异的群体频率。埃默里大学的机构审查委员会批准了这项研究。
2.GABA转运试验
如前所述，通过对载体pBluescriptSK?(Stratagene，SanDiego，California)中的大鼠GAT-1cDNA(它与人GAT-1有98的氨基酸同源性)进行定点突变，产生每个患者变体。用含10%胎牛血清、U/mL青霉素、mmolg/mL链霉素和2mmolL谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基(加州卡尔斯巴德)培养HeLa细胞。如前所述，感染重组痘苗病毒/T7病毒vTF7-3并随后转染表达载体pBluescriptSK?中的质粒DNA。GABA转运分析按照先前发表的方法进行。简而言之，用22.3nmol/L的[H]-GABA亚饱和浓度，进行放射性GABA的转运10分钟。每个突变体对GABA的摄取被归一化为野生型(WT)GAT-1，如图2的图例所示。GAT-1转运蛋白活性的统计评估使用单因素方差分析和后Dunnett多重比较检验，其中P0.05被认为是显著的。
3.微基因剪接试验
用PhusionHotStartII聚合酶(Invitgen；5‘-CACCTCCTGTCACCACATGCAATAC-3’，5‘-CTGCATCTTTCTAGCCATAC-3’)从人基因组中扩增出SLC6A1内含子7最后bp至内含子10前bp(NM_.3)的bp片段。将该片段克隆到pENTR/D-TOPO载体(Invitgen)中，用ASCI和SacII进行酶切鉴定。然后将SLC6A1片段网关克隆到pDEST拼接微基因剪接载体中，并用HindⅢ、XhoI和SacII进行酶切验证。随后使用QuikChangeXL定点突变试剂盒(AgilentTechnologies，SantaClara，California)通过定点突变将C.-2AG变体引入SLC6A1片段。Sanger测序证实了c.-2AG变异体的存在，并且没有任何不想要的替换。人胚肾(HEK)细胞在添加10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。用脂质体介导法将1.25μg的pDEST剪接载体转染HEK细胞。PDEST剪接载体包含两个插入物之一：(1)WTSLC6A1(图2B)或(2)SLC6A1c.-2AG(剪接突变体；图2C)。转染进行了一式三份。转染24小时后用PureLinkRNAMiniKit(Invitgen)提取RNA。在合成第一链cDNA之前，RNA在37°C下用DNase处理30min。用SuperScriptIII逆转录酶和寡核苷酸(DT)引物(Invitgen)合成第一链cDNA，然后根据SLC6A1(5‘-GATCATCCTGTTCTTCCGTGG-3’，5‘-GAAGATGACGAATCCTGCG-3’)外显子8和10的引物扩增cDNA。PCR产物用凝胶电泳显影。使用PureLink快速凝胶提取试剂盒(Invitgen)和Sanger测序提取条带以验证剪接产物。
讨论：
SLC6A1的变异首先在表现为肌阵挛无张力癫痫的患者中被发现，其特征是一系列的发作类型，包括肌肉阵挛发作、肌阵挛无张力发作、无张力发作和失神发作。此外，肌阵挛-无张力癫痫患者也有不同程度的智力残疾、发育迟缓，在某些情况下，自闭症谱系障碍和其他行为障碍。最近，约翰内斯堡等人发现SLC6A1的变异与全身性癫痫有更广泛的联系，失神发作和智能残疾是常见的表型。在本研究中，我们在癫痫患者中确定了8个SLC6A1变异体，并评估了它们的功能效应。使用放射性GABA转运试验，本研究中识别的五个错义变体、一个帧内缺失和一个无义变体被发现降低GABA转运(图2A)。三个变异体(p.G94E、p.WTer、p.GR)完全取消GABA转运。考虑到这种甘氨酸残基在底物转运过程中TM2的弯曲中所起的作用，p.G94E缺乏转运活性并不令人惊讶。类似地，p.GR可能由于引入带正电荷的精氨酸残基使TM12区域不稳定而导致转运缺陷。与WT相比，p.FS、p.Idel、p.YC和p.WR变异株的残余转运蛋白活性在2%到27%之间。P.FS和p.Idel位于细胞外环3，分别连接作为支架结构域和核心域一部分的TM5和TM6。这些结构域在底物转运过程中相对移动，细胞外环3连接子的扰动可能影响这一移动。最后，p.YC和p.WR都涉及跨膜边界附近芳香残基的替换。芳香族残基通常稳定跨膜结构域，因此，这些残基的替换可能会影响蛋白质的稳定性。利用微型基因剪接实验，我们还证实了c.-2AG变体破坏了SLC6A1的典型剪接，导致图2中排除了外显子9。SLC6A1癫痫变体对GAT-1功能有有害影响。在癫痫患者中发现的A、GAT-1野生型(WT)和错义变异体在HeLa细胞中瞬时表达。室温下10min测定钠依赖性[3H]-γ-氨基丁酸转运。结果表示三种不同转染方式的平均±标准差(Mean±SD)，三种转染方式一式四份。采用单因素方差分析和后邓内特多重比较检验，比较不同运输方式与WT的差异(*P0.)。B-C，示意图显示了转染HEK细胞的载体的预期剪接模式。预期的mRNA结构显示在基因结构下方。绿色箭头表示用于扩增cDNA的引物的位置。B、WTSLC6A1的拼接图案。C，预测了SLC6A1c.-2AG剪接突变体的剪接模式。星号表示C.-2AG变体的位置。显示拼接产品的凝胶图像。RT表示合成过程中逆转录酶的存在(+)或不存在(?)。核糖核酸是指在cdna合成过程中存在(+)或不存在(?)的核糖核酸。带有条带大小的bp分子量(MW)标记(Promega、Madison、Wisconsin)标记在左边。E，Sanger测序凝胶提取的条带的痕迹，显示外显子边界Mattison等人。mRNA转录本(图2C和2D)。这一结果预计会引入提前终止密码子，这可能会导致无义介导的衰退，并可能解释图2D中观察到的较微弱的突变PCR产物。随着越来越多的SLC6A1变异体被鉴定，量化变异体对GABA转运的影响的能力将为探索基因型-表型相关性提供机会。根据我们获得的临床信息，变异导致GABA转运活性完全丧失的患者和残留活性的患者在临床表现上没有明显的区别(表1)。例如，携带p.WR变异的患者2保留了27%的WT活性，表现为难治性失神癫痫、中度智力残疾和自闭症谱系障碍。这种表现类似于患者7，携带了完全取消运输活动的p.WTer变异体。我们假设GAT-1功能降低可能通过多种机制影响神经元兴奋性。GAT-1功能障碍预计会减少GABA的清除，导致突触和突触外GABA水平的增加。GABA水平的增加可能导致突触外GABAA和GABAB受体的过度刺激，这两个受体负责缓慢和持续的(紧张性)抑制反应。Cope等人表明，GABAA介导的紧张性抑制在GAT-1基因敲除小鼠的丘脑皮质神经元中增加。GABAA介导的紧张性抑制增加可以导致丘脑皮质神经元超极化和爆发式放电，这可以促进棘波放电的产生。同样，已知GABAB受体的长时间激活可以刺激低电压激活的(T型)钙通道，这可以通过连续的Na+峰在丘脑皮质系统内引起反复的兴奋。先前的研究表明，GABAB受体的激活导致小鼠和大鼠的失神发作，用GABAB拮抗剂预处理可以缩短化学诱导的失神发作的持续时间。GAT-1功能的降低也可以减少细胞内可用于激活GABAA介导的突触(相位信号)的GABA的量。GABAA介导的突触信号减少已经与遗传性癫痫中几个GABAA受体亚基的变异有关。同时，这些结果表明，GAT-1功能降低可能通过突触外GABAA和GABA受体的过度激活以及GABAA突触信号的减少而导致癫痫。综上所述，我们在例癫痫患者中确定了8个SLC6A1变异，其中5个是新的，代表了1.7%的诊断率。对这些变体的功能分析表明，GABA转运减少是常见的潜在疾病机制。
文献来源：
作者：KariAMattison12,KamerynMButler12,GeorgeAndrewSInglis12,OshratDayan3,HannaBoussidan3,VikasBhambhani4,BryanPhilbrook5,CristinadaSilva6,JohnJAlexander16,BaruchIKanner3,AndrewEscayg12
文献来源：WileyPeriodicals,Inc.?InternationalLeagueAgainstEpilepsy.
;59(9):e-e
DOI：10./epi.
影响因子：6.04
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