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♀Now开始学习吧♀♂问题1:常用重组蛋白生产的表达系统有哪些？
回答：大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统√大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统是目前应用时间最长、最成熟的表达系统，适合于表达非糖基化蛋白质及二级结构较简单的蛋白质，表达产物可在细胞质内形成包涵体，需要经过复性工艺；也可分泌目的蛋白于细胞间质，或在细胞质内可溶性表达，这种情况一般不需要复性。
√酵母表达系统酵母表达系统的特点是表达量高，适合于表达大量蛋白质和部分糖基化蛋白质，达产物一般分泌到胞外，可以直接从培养液中检测目的蛋白，不需要复性。目前毕赤酵母表达系统已经逐渐替代啤酒酵母表达系统。其主要特点为大规模发酵生产方便，比哺乳类细胞表达系统成本低，最显著优点是易于实现高效表达，尤其是多拷贝毕赤酵母表达系统，可在染色体上整合多个目的基因拷贝，表达水平高，典型的例子就是重组人白蛋白的表达体系；缺点是发酵密度高时，酵母的蛋白酶能够降解表达的目的蛋白，引起目的蛋白C端或N端氨基酸降解。
√哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统适合表达糖基化蛋白和空间结构较复杂的蛋白质，表达产物一般存在于细胞质中，如果在基因构建时于目的蛋白前加一段信号肽，表达产物会分泌到胞外，通过细胞翻译后包装成为有活性的蛋白质，目前一般采用CMV、EF-1a等强启动子。CHO属于该类表达系统，重组人红细胞生成素即采用这种表达系统。近年来，随着治疗性抗体药物的发展，相应的真核表达体系的研究也有了很大的发展，目的蛋白表达量能达到近10g/L细胞培养液。
♀抗体君♀♂问题2:哺乳动物细胞表达系统有哪些缺点？
回答：与微生物表达系统相比，哺乳动物细胞表达系统具有以下缺点√低效低产构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低。
√产物稳定性差某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化。
√费用高重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。
√构建周期长细胞株构建的周期较长，细胞倍增时间长。
√遗传学不稳定转染的细胞只在有限的代次内稳定。
♀抗体君♀♂问题3:CHO表达系统有哪些优点？回答：易于申报、具翻译后修饰能力、不分泌外源蛋白、高表达能力、易于放大培养√易于申报具有清晰的历史背景和监管机构的认可，易于申报。
√具翻译后修饰能力具有与人类相似的翻译后修饰能力，表达的蛋白生物学活性更加接近天然蛋白。
√不分泌外源蛋白该细胞属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白。
√高表达能力具有外源重组基因的高效扩增和表达能力。
√易于放大培养可浮培养或在无血清培养基中达到高密度培养，易于大规模生产，且有较高的耐受剪切力和渗透压。
♀抗体君♀♂问题4:CHO细胞系的来源？回答：CHO、CHO-K1、CHOK1SV、CHOZNCHOK1、CHOZNGS、CHO-S、CHO-DXB11、CHO-DG44√CHO年Puck通过将中国仓鼠卵巢组织酶解消化获得CHO细胞。
√CHOK年野生型CHO-K1存放于ATCC，年分离CHO-K1亚克隆，保存于ECACC。
√CHOK1SVLonza从ECACC获得CHO-K1驯化到悬浮无血清培养后，建立CHOK1SV细胞株。
√CHOZNCHOK年Merck从ECACC获得CHO-K1细胞株，于CDFusion中进行驯化，建立CHOZNCHOK1细胞系。
√CHOZNGSMerck在CHOZNCHOK细胞系基础上，通过ZFN（锌指核酸酶）技术敲除GS双等位基因，获得GS缺陷型细胞株CHOZNGS。
√CHOK1SVGS-KO年Lonza在CHOK1SV细胞的基础上，将细胞中GS的双等位基因完全敲除，得到CHOK1SVGS-KO细胞株。
√CHO-S年Thompson从原始细胞中分离了一株可用于悬浮培养的CHO细胞（CHOS），年Gibco将此细胞驯化至CDCHO培养基中，建立CHO-S。
√CHO-DXB1-80年代Urlaub和Chasin诱变的方法获得CHO-DXB11（CHO-DXB11只被敲除了1个位点，另一个位点为错义突变）。
√CHO-DG年Chasin筛选出了双等位DHFR基因敲除的CHO宿主细胞，并命名为CHO-DG44。
♀抗体君♀♂问题5:有哪些厂商可以提供CHO细胞系？回答：ATCC、ECACC、Lonza、Merck、ThermoFisher√ATCCCHO-K1,研发免费，商业提成。
√AECACCCHO-K1,研发免费，商业提成或买断。
√LonzaCHO-K1SV/GSKO,研发年费，商业年费+提成。
√MerckCHOZNGS,研发年费，商业买断。
√MThermoFisherCHO-S;CHODG44,研发年费，商业买断。
♀抗体君♀♂问题6:从研发到生产过程中所使用的细胞株是否可替换？回答：可以替换，但需进行可比性研究√可比性试验目的是确认细胞株变更前后制剂在质量、安全性和有效性方面是否具有可比性。
√指南可参考《人用生物制品可比性研究指南》文件。
♀抗体君♀♂问题7:从研发到生产过程中所使用的细胞株替换的最佳时间点？回答：三期临床样品生产前，产品上市变更√III期临床样品生产前能进III期表明了成药的可能性又增加了一步，此时细胞株和培养工艺可同时替换。
√上市后变更优点是时间更充足、时间、经济压力相对小；缺点是要求更高，工作量更大，绝对成本更大
♀抗体♂问题8:筛选压力对细胞生长和产物表达有何影响？回答：抑制细胞生长，提高蛋白表达稳定性、高浓度筛选压力导致变异√抑制细胞生长筛选压力能部分抑制细胞的生存能力。
√提高蛋白表达稳定性添加筛选压力能提高蛋白生产率，同时保持蛋白质质量属性和细胞系稳定性。例如：DHFR是催化二氢叶酸还原成四氢叶酸的酶，四氢叶酸是甘氨酸、胸苷一磷酸和嘌呤生物合成所必需的前体。氨甲喋呤（MTX）是叶酸的类似物，可以与DHFR结合并抑制其活性。从而使细胞在缺乏胸苷和嘌呤的培养基中死亡。当细胞在MTX的压力下生长时，只有DHFR基因扩增并高效表达的群体才能存活下来。随着MTX浓度的升高，存活下来的细胞DHFR扩增程度越高。能耐受高浓度MTX压力的细胞，可能含有几千个拷贝的DHFR基因。
√高浓度筛选压力导致变异在极高的筛选压力浓度(如-0μM)下逐渐培养细胞，可能导致靶基因变异，并可能对细胞克隆性和稳定性造成风险。
♀抗体♂问题9:表达系统的选择依据是什么？回答：考虑临床使用剂量，潜在临床需求总量、药效、安全性√目的：表达系统的选择是重组蛋白类药物开发的最重要环节之一。表达系统一经确认，将确认产品开发全过程的起点。选择构建适当的表达体系，需要筛选出能够满足中试研究的、表达量高的工程菌(细胞)，而中试工艺又将决定商业化规模的所有关键参数和种子库。
√依据：表达系统的筛选应综合考虑产品的临床使用剂量、潜在的临床需求总量等因素，在表达系统的筛选阶段也应全面评估系统对工艺稳定性的影响，尽可能选择目的蛋白高表达、杂质及相关杂质易去除的、并且安全性较高和药效较优表达系统。
♀抗体君♀♂问题10:CHO-S,CHO-DG44和CHO-K1的优缺点？回答：CHO-K1代谢偏好于抗体形成，CHO-S代谢偏好于生物量形成，CHO-DG44介于之间√文献报道1：CHO-S,和CHO-DG44相比CHO-K1在ActiCHOTMP培养基中表现出了4-6倍的细胞密度和抗体表达量增长，因此在批量培养期间CHO-K1显示出最佳的抗体生产性能，CHO-S最差，细胞存活时间和细胞密度与细胞抗体产量关系分析显示CHO-S表现出了最快的增殖速度，CHO-K1表现出了最好的抗体表达量。
√文献报道2：为了客观地类比三种细胞系表达抗体的情况，三种细胞系最终转染表达同一种抗体的质粒，根据生产实践挑选最好的适用于生产的细胞系。在细胞系制备筛选过程中，CHO-K1都变现出了它优秀的性能。培养基独立实验中发现CHO-S显示出更高的增殖速率，高于CHO-K1,CHO-DG%-50%,这属于细胞株固有的生长偏好特性，在未转染的CHO-S分批培养杨条件下也显示出比CHO-K1,CHO-DG44增殖速度快的特点。
√文献报道3：高抗体滴度和相对较低的生物量累积预示着CHO-K1有最好的抗体表达量。而CHO-S刚好相反，抗体表达量最低。CHO-DG44抗体表达量处于CHO-K1和CHO-S中间水平。这一趋势在两种培养基，三种培养条件下都是一致的。
√文献报道4：高抗体滴度和相对较低的生物量累积预示着CHO-K1有最好的抗体表达量。而CHO-S刚好相反，抗体表达量最低。CHO-DG44抗体表达量处于CHO-K1和CHO-S中间水平。这一趋势在两种培养基，三种培养条件下都是一致的。
√总结：CHO细胞系产物合成率的差异可能要归咎于不同细胞系不等同的翻译效率及其处理加工的容量。比如最新发现的CHO-K1细胞比起CHO-DUXB11细胞有更大的内质网，更丰富的线粒体以及与之对应的高细胞特异性抗体表达量。内质网对于分泌蛋白的折叠组装非常关键，如果一个内质网里不可逆错误折叠的蛋白超过一定限度，细胞将启动未折叠蛋白响应机制，最终发生细胞凋亡。因此大内质网有利于分泌蛋白的高产率也有利于高产细胞的存活和蛋白加工。丰富的线粒体基质有利于细胞自我供能便于内质网加工处理未折叠的蛋白。由于内质网和线粒体占据了细胞内大量的空间，因此抗体表达量也反映在细胞体积大小上，研究发现灌流培养时高产的CHO-K1细胞直径15.7μm±0.7，CHO-DG44直径14.2μm±0.5，CHO-S直径13.7μm±1.1。
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♀精彩回顾♀1抗体药物质量研究的共性问题2生物制药项目经理（PM）必读的十本经典书籍（免费下载）3单克隆抗体作用机制汇总-Fab和Fc相关4抗体异质性对抗体药物功能和代谢影响的研究5单克隆抗体药物制剂处方的作用6抗体药物靶点总结7单克隆抗体电荷异质体的形成机制及调控策略8单抗聚体的形成原因与调控策略备注：点击题目即可查看
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