类器官的研究是近年来的热点，其具有细胞模型所没有的空间结构，又能避过动物模型的复杂性，是绝佳的体外实验模拟工具。
近日，一项在Nature上发表了一篇研究，通过绘制调节肠道类器官发育组装过程的功能性遗传互作图谱，来理解肠道组织再生的分子机制的文章。
研究亮点
揭示了肠道类器官的形成机制
发现了视黄酸受体平衡细胞再生和分化的功能
首次展示了调控类器官发育和自我组织的功能性基因相互作用图谱
研究背景
本文的研究人员一直在肠道类器官的领域钻研，在的研究文章中，初步揭示了肠道类器官的发育机制，发现了Yap1这个组织整合性的传感器：单细胞的再生过程由Yap1的激活所驱动，反映了肠上皮的再生和内稳态的重建过程。然而，肠道类器官的发育机制仍然未完全揭晓，再生过程中组织在空间上的组合和协调过程仍然是个谜题。因此作者进行了下面的研究。
在这篇文章中，研究人员构建了一种基于图像的表型筛选平台，经过化合物文库处理的40万个类器官进行分析，从而评估哪种化合物能影响类器官的功能，这一数据库能帮助研究人员识别出参与类器官发育的个基因，同时研究者还还绘制出了这些基因之间的功能性遗传互作图谱，筛选的化合物中包括一种视黄酸信号通路抑制剂，其能促进类器官表型的再生，并通过实验进行了验证。做类器官相关课题的小伙伴可以看一下这个基因网络，看看能否从中吸取灵感！！！
分析流程
大致可以分为三部分：
结果和主要发现
1.寻找研究对象
研究人员首先利用高通量筛选的方法先确定研究对象
将单细胞培育成类器官，培养4天，用激酶抑制剂、核激素受体等种化合物处理。肠上皮细胞、Paneth细胞、DNA和蛋白被分别标记，然后进行高通量成像（下图a）。
作者分析了大约,个类器官，成像流程大致可以归纳为：确定类器官水平的多种特征集→通过表型相似性进行聚类→生成表型指纹图谱（下图b）。
作者将类器官聚类成15类表型。为了更好地阐释实验结果，作者降低表型的分辨率，将它们分成7大表型。（下图c）
作者通过初筛和验证后共鉴定出个化合物，这些化合物对表型影响的重复性极高，这些化合物分别靶向对应的个独特的基因。这个基因部分是已知的，与类器官发育和体内平衡的信号传导途径相关如Wnt、Notch和转化生长因子-β（TGF-β）途径；部分基因还未揭示其在类器官发育中的作用，例如核受体信号。
随后作者建立PPI网络（下图d），阐明基因相互作用的关系。上游调节剂和关键参与基因得以确定，它们与经典Wnt信号的主要作用一致，如β-catenin。
此外，还确定了6个高度关联的子网，这些子网显示了特定指纹和功能注释的丰度。
2.确定关键基因
作者在处理类器官时，发现使用类视色素X受体（RXR）拮抗剂RXRi时观察到了最显著的变化。于是，猜想RXR可能与类器官的发育有密切关联，因此团队用抑制和激动RXR的方式来观察其对类器官的影响：
抑制RXR显著减少了肠上皮细胞数量；而RXR激动剂增加了肠上皮细胞的分化，但不能弥补RXR抑制剂诱导的分化缺陷（下图a）。
以上结果提示RXR发挥作用并不依赖视黄酸，因此作者转向Notch信号传导（类器官发育）和YAP1（推动单个肠道干细胞向肠类器官发育）定位。
RXR抑制剂处理的类器官中观察到核内YAP1的留存，但未发现表达Notch配体DLL1的细胞。相反，RXR激动剂处理的类器官中，YAP1始终位于细胞质中（下图b）。
以上结果说明，RXR抑制剂和激动剂处理均使类器官无法打破对称的形态，并伴有同质的YAP1定位。
作者在YAP1主要处于非活动状态时（第3天），激活/抑制RXR处理类器官。
激活/抑制RXR显著影响了肠上皮细胞的生长，结果同前，但对Paneth细胞无明显影响（下图c）；
而第3天RXR抑制剂处理也没有导致YAP1的核易位（这表明RXR不参与YAP1的直接激活，而是在其功能活跃时控制其核输出）。
实验做到这一步，作者已经发现了RXR（视黄酸代谢相关的分子）在类器官发育中的重要作用。下一步怎么做，和大家一样，作者也去查文献了。
作者查询了维生素A（即视黄醇）的代谢，得知维生素A代谢的相关基因就是与肠上皮细胞相关的，尤其是视黄酸脱氢酶（ALDH1A1）。
于是作者进一步设计实验，来揭示ALDH1A1与类器官发育的关系。抑制实验通过敲除ALDH1A1、抑制ALDH1A1的单细胞培养环境和无VitA的单细胞培养环境，激活的方式则为增加RXR激动剂。
无VitA的培养环境没有干扰YAP1定位和单细胞形成正常的组织形态结构。
这表明视黄酸代谢是肠上皮细胞分化所必需的，但对于Paneth细胞却不是，也不影响表达YAP1的再生细胞。
3.RXR抑制剂功能验证
视黄酸受体(RAR)依赖的信号通路对肠上皮细胞分化很重要，而RXR激活维持再生和肠上皮细胞分化之间的平衡。因此作者使用RXR抑制剂RXRi处理细胞，并进行单细胞时序RNA测序。
首先对基因整体表达的水平进行了分析，发现含有RAR/RXR基序基因的细胞高表达，证明了目标基因RXR在第3天被诱导并与肠细胞功能相关（下图a）。
接下来对单个基因表达的情况进行了分析，RXRi处理的细胞YAP靶标相关的基因显著上调，用RXR激动剂处理则导致再生特征的减少和肠细胞快速成熟（下图b,c）。
YAP的再生特征和靶点仅在最开始处理的类器官中显著上调，证明RXR抑制剂可以维持YAP1的活跃状态，但不能激活它。与此相一致，两组细胞中肠上皮基因均下调，而Paneth细胞的标记基因仅在早期处理中下调（下图d）。
最后作者在小鼠体内验证RXR抑制剂的再生促进作用。在接受辐照的小鼠中，RXR抑制剂处理可减少去细胞作用，改善屏障功能，促进绒毛生长，尤其是培养后期效果更为明显。
总结
作者首先通过高通量筛选的方法，找到了影响肠道类器官发育的关键基因，接下来确定了视黄酸核受体具有调节细胞命运转变的功能和维持再生和内稳态之间平衡的功能，最后验证了视黄酸受体抑制剂能改善小肠再生的功能。这篇文章针对类器官发育过程，使用多元表型筛选方法来识别可在体内进行研究的生理相关靶标，揭示了影响肠类器官发育的机制，很有参考价值。
参考文献：
Lukonin,I.,Serra,D.,ChalletMeylan,L.etal.Phenotypiclandscapeofintestinalorganoidregeneration.Nature,–().
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