FrontOncol
09Oct0
IF:4.
Introduction胶质母细胞瘤(GBM)是最常见的原发恶性脑肿瘤，尽管目前的治疗标准有所提高，但预后依旧很差。GBM的侵袭性阻碍了治疗效果，并导致肿瘤复发。因此，调控胶质瘤细胞侵袭的分子途径在GBM的致病性中起主要作用。浸润性的GBM干细胞样细胞在瘤周实质中已被发现，它们在化疗和放疗的耐药性形成中发挥作用。GBM的另一个特征是缺氧，它与较差的预后和治疗耐药性有关，其在GBM细胞侵袭中发挥作用。
缺氧可触发复杂的肿瘤细胞反应，通过激活多个分子通路，如PI3K/Akt、Wnt/?-catenin、Hedegehog、TGF?和酪氨酸激酶受体等，促进周围实质的迁移和侵袭。缺氧通过HIF与含有HREs的基因启动子结合而改变这些基因的表达。然而，尽管已知低氧会改变DNA甲基化状态，低氧通过基因启动子甲基化调节GBM细胞迁移的机制尚不清楚。
ODZ是一种II型跨膜蛋白，它通过上调RhoA-ROCK通路而与GBM细胞的迁移能力有关，RhoA-ROCK通路导致细胞骨架重塑、细胞迁移和肿瘤周围实质的侵袭。然而，能够上调ODZ的细胞外触发因子尚未被描述。
在本研究中，我们发现缺氧能够诱导GBM细胞ODZ的表达，ODZ启动子的甲基化状态在调节该细胞迁移诱导剂的水平中起主要作用。
Results缺氧上调GBM肿瘤标本中ODZ的表达肿瘤细胞的迁移被认为是由包括缺氧在内的微环境应激引发的，这是GBM的特征之一。为了确定ODZ的表达是否与GBM中的缺氧有关，分析了ODZ蛋白在缺氧区和常氧区的表达(图A)。
与正常缺氧区相比，重度缺氧区ODZ胞核和胞浆表达增强。在外源性缺氧标记PIMO染色阳性的区域中，高达80%的区域为ODZ阳性，而在PIMO阴性区域中，0%的区域为ODZ阳性(p0.05)(图B)。
缺氧上调ODZ转录促进GBM细胞迁移为了确定低氧是否导致ODZ的表达增加，在低氧条件下(%O)培养了原代GBM细胞，发现大多数细胞仍然存活。在低氧条件下培养的细胞能够从培养基中吸收PIMO，而在常氧条件下生长的细胞则不能(图A，B)。
与之前的研究结果一致，在缺氧条件下ODZmRNA的表达增加了4倍(p0.05)(图C)。此外，如图D所示，缺氧促进了GBM细胞的迁移(增加了倍多，p0.05)。
为了研究ODZ是否参与了缺氧诱导的迁移，我们用两个特定的shRNA敲除了ODZ，发现ODZmRNA水平的有效下调与缺氧条件下GBM细胞迁移的减少有关(p0.05)(图E，F)。
另一个GBM细胞株也得到了类似的结果(补充图)。
然后将ODZ启动子克隆到含有荧光素酶报告基因的质粒中。在低氧条件下，转染此基因的GBM细胞荧光素酶活性增加倍(p0.05)(图G)，进一步证明了低氧对ODZ的表达及含有缺氧反应元件的启动子的影响。
ODZ启动子甲基化状态因缺氧而改变缺氧导致GBM肿瘤细胞、DNA甲基化(图3A)。利用细胞分选机(图3B，C)从0例GBM患者的手术标本中分离出PIMO阳性和PIMO阴性的肿瘤细胞，并分析了ODZ启动子的甲基化状态。
将重点放在转录起始点上游.4kb的片段上，该片段没有典型的CpG岛，而是8个CpG位点。对55例来自TCGA的GBM的分析表明，与正常脑组织相比，其中两个CpG位点(cg和cg)在GBM中处于低甲基化状态，而另外两个CpG位点(cg和cg)位于基因体中，远离转录起始点，在正常脑和GBM中具有相似的甲基化状态(图3D)。
基于甲基化状态的KaplanMeier生存分析显示，cg位点低甲基化与生存不良呈趋势相关，但无统计学意义(补充图)。
对分离的PIMO阳性和阴性细胞中ODZ启动子(cg和cg)上的CpG位点的甲基化状态进行分析，发现在PIMO阳性细胞中只有cg发生了差异甲基化(图3E)，这与ODZ在低氧条件下的高表达是一致的。
ODZ启动子中cg启动子甲基化或突变降低基因表达在克隆到荧光素酶报告基因之前，利用M.SssI甲基转移酶催化甲基化ODZ启动子上的CpG位点(图4A)。我们用HpaII消化质粒，证实了甲基化启动子的存在，HpaII切割了启动子两侧的pGL-荧光素酶的未甲基化CCGG位点，而使启动子内的甲基化CCGG位点保持不变(图4B)。
用HpaII消化DNA，然后用cg两侧的引物进行PCR扩增，以确定该位点的甲基化状态。只有启动子甲基化的质粒才有扩增信号(图4C)。将含有ODZ甲基化启动子的报告质粒转染GBM细胞，缺氧通过未甲基化的ODZ启动子诱导荧光素酶活性(图4D)。然而，当启动子中的CpG位点甲基化时，这种活性就被取消了。
为了评估cg的特异性相关性，通过定点突变引入了C到A的改变(图5A)，并通过HpaII酶切(图5B)和测序进行了确认。与之前的结果一致，转染野生型启动子-报告质粒的GBM细胞在低氧条件下增加了荧光素酶的活性(p=0.)，而含有突变启动子的细胞没有增加荧光素酶的活性(图5C)。
Conclusion缺氧是GBM微环境的主要生物学特征之一，与治疗耐药和预后不良有关。我们发现缺氧的肿瘤区域表达更高水平的ODZ，缺氧通过调节ODZ启动子的甲基化状态诱导GBM细胞ODZ的表达。低氧诱导的ODZ表达上调与GBM细胞较高的迁移能力有关，这种迁移能力因ODZ的下调而显著降低。在体外，ODZ启动子的甲基化降低了它的反式激活活性，我们在启动子的3‘端发现了一个具有功能活性的CpG位点。该位点在体细胞中发生高甲基化，在GBM细胞中主要发生低甲基化。该CpG位点的突变降低了启动子对缺氧的反应活性。总之，我们认为低氧是ODZ表达的激活剂，并且低氧至少部分地通过调节ODZ基因启动子的甲基化状态来控制ODZ诱导的迁移水平。
Reference:HypoxiaCanInduceMigrationofGlioblastomaCellsThroughaMethylation-DependentControlofODZGeneExpression
PMID:
DOI:0./fonc.09.
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