摘要：谷氨酸棒杆菌是生产氨基酸，有机酸等的重要菌株，广泛应用于食品，医药领域。利用基因编辑技术对谷氨酸棒杆菌进行基因功能研究，在提高目的产物产量，发现新的基因功能等方面有重要意义。其中，CRISPR技术以其快速，简便，编辑效率高等优点成为现阶段研究者用于改造谷氨酸棒杆菌的主要技术，但是更为简单，高效的编辑手段依旧需要进一步研究开发，以获得优良菌株应用于工业生产中。
关键词:谷氨酸棒杆菌，基因编辑，同源重组，CRISPR谷氨酸棒状杆菌（Corynebacteriumglutamicum）是从土壤中分离到的一种非致病性的兼性厌氧菌，是革兰氏阳性菌[1]。在20世纪50年代研究发现谷氨酸棒状杆菌可以高产谷氨酸之后，，新的微生物发酵生产技术成为氨基酸生产的主要技术，由此开启了谷氨酸工业生产的新纪元。除谷氨酸外，谷氨酸棒状杆菌还被用于赖氨酸、异亮氨酸和维生素D等的生产[2-5]，在食品、医药、农业等领域得到了广泛应用。随着分子生物学技术的发展，谷氨酸棒状杆菌在基因工程改造方面的研究逐渐深入。Ozaki等于年首次从谷氨酸棒状杆菌中分离得到质粒DNA并进行基因操作[6]。基于这些质粒，研究人员构建了大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭载体，并建立了高效的DNA转化技术。从此，谷氨酸棒杆菌中的基因操作技术得以开发，并成功地用于基因功能的分析及生产菌株的构建[7]。目前，已经对53株谷氨酸棒状杆菌进行了基因组测序，如谷氨酸棒杆菌ATCC[8]、谷氨酸棒状杆菌S[9]、谷氨酸棒状杆菌ATCC[10]等，为深入了解谷氨酸棒状杆菌的代谢机制、发掘其更多生产功能提供了依据。基因编辑技术是对生物体内源基因进行DNA的插入、删除、修改或替换[11]。传统的基因编辑技术主要是以同源重组为基础进行基因组的定向修饰，随着基因工程技术的不断发展，基于核酸酶的基因编辑技术得以开发利用，其原理是通过核酸酶特异性地识别并切割靶DNA双链，激发细胞内源性的修复机制，从而实现基因定向改造[12-13]。1、传统基因编辑技术传统基因编辑技术主要依赖于同源重组，将含有目的基因同源序列的外源基因导入宿主菌，然后通过核酸链间等位替换的方式对目的基因进行突变、缺失或插入[14]，主要包括自杀质粒介导的同源重组、Cre/loxP介导的位点特异性重组、RecT介导的单链重组等多种方式，在谷氨酸棒状杆菌中均有报道。
1.1自杀质粒介导的同源重组
自杀质粒，也称非复制性型质粒，其携带的复制元件可以在大肠杆菌中正常作用，但在待改造菌株中无法正常发挥其功能[15]。自杀质粒介导的同源重组又分为一次交换重组和双交换重组两种方式。一次交换重组主要是通过引入抗性标记的方法使外源基因插入宿主菌的基因组中，从而使目的基因失活。但是，抗性基因的引入可能造成极性效应，影响菌体的生长或其他功能性基因的表达。为了克服这一缺陷，双交换重组得到了应用，即在一次交换重组的基础上再进行一次等位替换，丢掉基因编辑过程中不需要的外源部分(图1[16])。在谷氨酸棒状杆菌中，依赖于双交换重组的基因敲除系统主要是通过含有反向筛选标记的自杀性质粒来实现的，其中最常用的反向筛选标记为蔗糖致死基因sacB基因。年，Ma等[17]开发了upp基因作为反向筛选标记，并结合SceⅠ介导的重组系统，实现了突变体的高效筛选。此外，与自杀质粒具有相同作用的条件复制型质粒也经常出现在谷氨酸棒杆菌的基因编辑过程中。目前在谷氨酸棒状杆菌中有报道的主要是温度敏感型质粒，其在不同温度条件下，质粒拷贝数不同[18]。随着基因工程的发展，已经有研究尝试含有将sacB负筛选标记的自杀质粒与温度敏感型复制子相结合，来提高谷氨酸棒状杆菌基因敲除过程的筛选效率[19]。
图1由自杀质粒介导的基因敲除的双交换重组机制[17]
2、CRISPR技术CRISPR(Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats)，即成簇的、有规律的、间隔短回文重复序列，是广泛存在于细菌和古菌中的特异性保护机制，用来抵御病毒、外源DNA等的入侵[20]。现阶段基于CRISPR的基因工程改造技术主要分为CRISPR干扰(CRISPRinterference，CRISPRi)调控目的基因表达[21]和CRISPR/Cas9蛋白介导的基因敲除、插入，以及CRISPR介导的碱基编辑3个方面。
2.1基于双链断裂的CRISPR技术
CRISPR/Cas介导的基因编辑系统中研究最为成熟的是CRISPR/Cas9系统[22]，其最早被发现于酿脓链球菌，该系统结构简单，作用快速，被广泛用于动、植物以及微生物的基因功能研究[23-24]。Martin等于年报道了CRISPR/Cas9系统的结构，其仅包括一个Cas9蛋白以及crRNA和tracrRNA两个非编码的RNA，当有外源DNA进入细胞后，菌体自身的RNaseⅢ催化crRNA成熟，然后与tracrRNA结合形成双链，从而引导Cas9蛋白与靶序列结合，并对双链DNA进行剪切，形成双链断裂(Doublestrandbreaks，DSB)，再通过非同源修复与同源修复两种机制来实现基因编辑，且成功实现了体外20bp重复间隔序列区域双链的靶位点特异性切割[25](图2)，有研究者认为cas9基因在质粒上的表达具有不稳定性，且对谷氨酸棒杆菌进行双质粒的共转化时需要较高的转化效率，所以将cas9基因整合到基因组DNA上，构建了含有gRNA和同源修复模板的单质粒体系[26]。随着研究的进一步深入，关于CRISPR/Cas9系统在谷氨酸棒状杆菌的应用体系不断在更新、优化，Coates等[30]研究表明，并不是所有类型的复制子都能将CRISPR/Cas体系成功引入谷氨酸棒状杆菌。2.2CRISPR碱基编辑
对于缺乏非同源末端修复(Non-homologousendjoining，NHEJ)的菌株，为了克服基因编辑过程中双链断裂产生致死效应[27]，对CRISPR编辑系统不断进行优化，除了在构建敲除体系时加入同源臂以外，一种更为简单的编辑工具——CRISPR碱基编辑系统得到了开发利用。CRISPR碱基编辑，顾名思义就是通过对碱基进行修饰实现基因的突变、失活等。
图2CRISPR/Cas9介导的基因编辑
3、谷氨酸棒杆菌基因编辑的发展趋势在谷氨酸棒状杆菌基因工程技术发展过程中，由传统的基因编辑技术到以人工核酸酶介导的基因编辑技术，不断有旧的、有缺陷的编辑方法被淘汰，新的、简单的方法得到开发应用。
同源重组介导的基因编辑体系作为最早的基因工程改造系统，其使用范围非常广泛，且操作简单，对于新物种的基因功能研究仍然具有重要意义。开发新的反向筛选标记以提高同源重组介导的基因编辑效率是非常必要的。
CRISPR系统相较于其他编辑系统来说具有操作简单、易筛选等多个优点，被广泛应用于各种动植物、微生物等的基因编辑，为基因功能的研究作出了巨大贡献[28]。但在使用过程中发现，该技术仍存在一些需要改进的不足之处。首先，CRISPR碱基编辑技术的开发一定程度上提高了基因编辑的精确性，但是，该技术在使用过程中仍会存在一定的脱靶效应，已经不断有研究者对这个问题进行改进；其次，CRISPR系统在使用过程中存在物种特异性，所以需要通过寻找不同来源的Cas蛋白来扩大其适用范围。CRISPR系统相较于其他编辑系统来说具有操作简单、易筛选等多个优点，被广泛应用于各种动植物、微生物等的基因编辑，为基因功能的研究作出了巨大贡献[28]
4、结语谷氨酸棒状杆菌的基因编辑手段在不断地更新和完善。但是，作为一种重要的工业生产菌株，谷氨酸棒状杆菌的遗传体系及其代谢规律的研究并不是很深入。为了得到更多新型高效的生产菌株，我们仍需要对基因编辑手段进行不断的改进和探索，使所获得的优良菌株更好地应用于工业化生产。
参考文献
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