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大家好，欢迎来到,今天和大家谈一下用10Xgenomics的方法来分析基因组上的结构变异。
关于这个10Xgenomics的系统，之前在的第56期视频当中讲过。它是一个油包水的微滴发生系统，结合了带有特殊DNA序列标签的微珠，再加上一系列的酶反应，整合成的一个系统。
目前，它的主要的应用有2个。
第一个应用是做基因组的结构变异分析、或者基因组的Denovo组装。
另一个应用是做一群细胞当中，每个细胞的RNA表达情况的定量分析。
今天我们主要讲它在分析基因组结构变异当中的关于RNA表达分析的应用，有兴趣的同学可以找一下当中第56期视频，那个视频里面有详细的说明。
我们接下来说这个分析基因组结构的应用。
二代测序高速发展。目前对于测定长度在几百个碱基以内的DNA片段，已经驾轻就熟。但是对于染色体单倍体型的分析（连续的长片段分析），还是有一定的困难。还需要其它的分析手段来帮忙，才能更好地分析出染色体的单倍体型。10Xgenomics的方法就是其中之一。
这个方法的原理是这样的。
一、先预制凝胶微珠，英文叫gelbeads。
在每个凝胶微珠上，种上特定的DNA片段。每个DNA序列，分成几段。
第一段是P5和read1序列，这段序列会在未来建库的时候与建库引物相结合。
第二段是一段Barcode。这段Barcode是16个碱基的长度。一共有万种Barcode，一个微珠对应于一种Barcode。通过这万种Barcode，把凝胶微珠给区分开来。因为有万种Barcode，所以各个微珠之间的Barcode重复概率极小。任意两个Barcode之间至少相差两个或两个以上的碱基。这样可以避免因为测序的时候对碱基的误读，而导致把两个Barcode搞混。
第三段是多个碱基的随机序列。这段随机序列起到的作用是与被扩增的DNA链上的多个位点结合，扩增出更多的DNA片段来。
二、接下来，我们来看芯片上的液流管路。
这里，是准备好的凝胶微珠。
DNA溶液在第一个十字交叉口，与凝胶微珠混合到一起。
然后进入第二个十字交叉口，油相在这个十字交叉口加入进来。油把凝胶微珠和DNA的混合液包裹成一个又一个的油包水的小液滴。这些小液滴里面是水相，外面包裹的油相。
从总体上来说，这许多油包水的小微滴，就组成了一个乳浊液。
3，做一次生成乳浊液的反应，大约得到万个有效的微滴。
所谓有效的微滴，就是既包含有微珠、又包含有DNA片段。同时这个微滴中还有接下来扩增反应所需的酶、和其它辅助成份。最终能够进行DNA扩增的微滴。
4，一次反应用掉的DNA量大概是1纳克。
如果DNA的片段长度在50K~K的左右，那么1纳克的DNA大约是一千万条到两千万条DNA。这些DNA链最终约有一半左右会被包到有效的微滴当中。所得到的约万个有效的微滴当中，平均每个微滴会含有5~10条DNA链。
三，DNA的扩增。
有效的微滴当中，就会发生DNA聚合反应。也就是微珠上的这个DNA引物最末端的随机序列，与DNA长链相结合。在DNA聚合酶的作用下，进行DNA扩增。
扩增出的新的DNA片段，上面都带有了这个微珠所特有的Barcode。
第四，建库。
把这个乳浊液当中所有的水相抽出来，把DNA片段建成Illumina的测序文库。
第五，把文库拿到illumina的测序仪上进行测序。
接下来说如何用上述得到的测序数据做基因组结构分析。
这里以人为例。
1，先把上面测序所得到的序列比对参考基因组上。
这个图的最下方，就是参考基因组序列。我们现在看到的堆积起来的小点，每一个小点就是一条测序序列。
2，按照每条序列上所带有的Barcode序列，进行分类。
也就是我们现在看到的，之前堆在一起的序列，被分别排成了一条一条的横线。这一条横线上的序列，就被称为linkedreads，也就是“相连的序列”的意思。
如果这些序列在参考基因组上相距的距离不是太远，就被推测认为，可能是来源于同一条长片段DNA的。进而可以被推测认为，是来源于同一条染色体的。
3，接下来，判读这些reads中的变异，可以得到大量的突变点。
4，再接下来，把带有相同突变点的linkedreads归类到一起。
我们就可以清楚地看到，这些linkedreads分成两个大组。
我们自然地可以想到，其中一组linkedreads是来自于父亲的；另一组linkedreads是来自于母亲的。
这样我们就把父源、和母源的两条染色体各自的单倍体型给搞清楚了。
接下来，我们来看两个真实样本的分析案例。
这是NA样本中的一段基因。上面灰的这张图是用传统的二代测序数据分析得到的结果。可以看到中间这一段覆盖的reads数少了一些，可以推测这里可能是有一个片段缺失。
而用10X的方法来分析，可以清楚地看到，在第二条染色体上有一个个碱基的大缺口。这是一个明显的大片段缺失。
再看这个例子，用传统的文库，可以看到这中间是覆盖了一些reads，也许有片段的重复。
改用10X的方法来分析，可以清楚地看到中间有个碱基的片段重复。
从上面两个例子，我们都可以看到：用10Xgenomics的方法，可以清楚地看到原来用Illumina标准测序方法看不太清楚的基因组结构变异，帮助做出明确的判断。
所以说10Xgenomics的方法对于分析基因组结构变异，有很大的帮助。
另外，10X还可以用于做基因组的Denovo组装，同样也是利用大跨度的linkedreads，可以轻松地拼出大的基因组骨架（scafflod），以方便组装整个基因组。
以上是本期视频的全部内容，谢谢您的收看。
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