▍导语
近日，匹兹堡大学医学院研究人员利用CRISPR基因编辑技术开发出一种新型的基因疗法，能够有效靶向作用促癌“融合基因”，并且改善恶性肝癌和前列腺癌小鼠模型的生存率。本周由GEMPLE捷易技术部为大家详细解读此篇文献。
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解读专栏
01研究思路：
基因组不稳定导致的基因重排与突变是肿瘤的标志特征之一，许多肿瘤都被发现含有特异的融合基因。本文作者运用Cas9nickase技术，在融合基因接口两端分别设计sgRNA识别位点，介导自杀基因HSV1-TK特异性插入肿瘤的融合基因拼接位点，而不影响不含融合基因的正常细胞，从而特异性识别并杀死含有相应融合基因的肿瘤细胞。
02实验过程：
1）EGFP-tk插入策略：作者针对融合基因两端设计Cas9切口酶识别的正/负链sgRNA与Cas9n共同包装于一腺病毒载体，同时针对融合基因接口两端设计同源臂并插入EGFP-tk（绿色荧光和自杀基因）包装于另一腺病毒载体。两种腺病毒同时感染含有相应融合基因的肿瘤细胞时，可以介导EGFP-tk基因的插入。而EGFP-tk的插入使得肿瘤细胞对Ganciclovir(更昔洛韦)敏感，从而引起肿瘤细胞死亡。（Ganciclovir：可被HSV1-TK特异性磷酸化，产物抑制DNA合成。）
Figure1SchematicofstrategytointroduceEGFP-tkintothebreakpointoftheTMEM–CCDC67fusiongene.
2）构建表达TMEM-CCDC67-fusion的单拷贝过表达稳转细胞株（PC3BP和DUBP）.
作者发现用图1中的策略，感染含有sgRNA/Cas9n和打靶载体的腺病毒后，含有TMEM-CCDC67融合基因的细胞株PC3BP和DUBP有15~16%的细胞整合了EGFP-tk，而不含融合基因的对照细胞株PC3CMV和DUCMV中，EGFP-tk的整合比例只有1%。提示本策略可以较为特异的识别含有相应融合基因的肿瘤细胞。
Figure2EGFP-tkintegrationandexpressionincellsexpressingtheTMEM–CCDC67-fusionbreakpointtranscript.
3）本图提示肿瘤细胞在插入EGFP-tk后，可被Ganciclovir(更昔洛韦)诱导细胞凋亡。而未插入EGFP-tk的对照细胞，仍对Ganciclovir不敏感。
Figure3TreatmentwiththenucleotideanalogganciclovirkillscancercellsexpressingEGFP-tk.
4）本图裸鼠成瘤实验进一步证实，本策略可以抑制含有相应融合基因的移植瘤的增殖与转移，并提高裸鼠的存活率。
Figure4TreatmentwithganciclovirinducespartialremissionofxenograftedprostatecancersinSCIDmice.
5）为了验证实验的可重复性，作者在以前的RNA-Seq中发现的HUH7细胞中存在MAN2A1-FER融合基因，并针对这一融合基因设计治疗腺病毒。发现不管是在细胞水平还是在裸鼠成瘤实验中，治疗腺病毒和Ganciclovir联用都能很好的促进HUH7细胞的凋亡、抑制肿瘤增殖和转移，降低死亡率。
Figure5GenometherapytargetingattheMAN2A1–FERbreakpoint.
03实验讨论：
1、作者首次利用CRISPR/Cas9技术特异性识别并杀死肿瘤细胞，从而介导移植瘤的部分缓解。
2、但在癌症治疗的压力下可能产生额外的新突变和融合基因。
3、由于每位患者体内的融合基因可能并不一样，因此利用此策略的靶向治疗需要个体化。
以上就是文章《TargetinggenomicrearrangementsintumorcellsthroughCas9-mediatedinsertionofasuicidegene》的全部内容啦，若有疑问欢迎随时咨询！我们下期文献详解再见稿件来源：技术部杨通博士
稿件编辑：GEMPLE捷易市场部
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