来源：MolPlant植物科学
CRISPR技术在近几年日新月异，已经成了精准农业和现代植物分子生物学研究必须的手段。其高效、特异、精确和安全性给现代农业发展、设计育种等带来革命性影响。但是对于目前多种不同的CRISPR方法，手段及其应用范围却缺乏系统性总结。
PlantCommunication杂志于7月23日全文发表来自FlorianVeillet等人带来的题为“PrecisionbreedingmaderealwithCRISPR:illustrationthroughgeneticresistancetopathogens”的综述。该综述非常详尽介绍了目前植物使用的多种CRISPR系统及其运用的PAM识别和相应的基因编辑范围。并且以植物病理学为例，总结了CRISPR已经取得的一些应用例子，并且展望了未来CRISPR将要取得的应用成果。另外作者对抗病基因R基因和易感基因S基因精准基因编辑工程提出了新的设想。
基因编辑技术主要是应用基于在靶点附近双链DNA错配修复过程产生的多种随机错误引入，插入或缺失从而达到基因编辑的效果。一个很关键的因素是需要找到稳定的DNA核酸酶进行特异性识别靶点，进行特异性切割，形成缺口，激活植物自身的DNA修复。而在所有的修复过程中，有模板的DNA修复其精确性极高，达不到引入突变的目的，只有DNA双链断裂修复是一种无模板的修复机制，容易引入插入或者删除突变。
目前常用的Cas系统主要有2种，CRISPR-Cas9系统，CRISPR-Cas12(a和b)系统。CRISPR-Cas9系统应用最为广泛，主要来源2类II型嗜热链球菌适应性免疫系统，融合了DNA内切酶和单链向导RNA(sgRNA)可以识别特定的PAM模体。定位后在本地DNA行成R-loop结构引发SpCas9介导的DNA剪切，启动双链断裂修复，造成错配。Cas12a和Cas12b系统分别来源于毛螺菌和阿利克巴氏杆菌，主要应用了不同的核酸内切酶和识别靶点。他们剪切DNA的时候会产生4-5bp的粘性末端，在富含T的区域产生DNA双链断裂。这两者主要的区别是Cas9更多产生小范围插入/缺失，而Cas12产生大片段的缺失。
CRISPR介导的基因编辑是一个笼统概念，但是精确来说可以细分为3种不同的编辑策略。第一种是基于同源重组方法对植物引入DNA双链断裂修复导致插入/缺失。第二种方法与同源重组不同，是没有诱发DNA双链断裂修复的通过碱基编辑器进行单碱基定向精准编辑的方法。目前主要存在C-T或者A-G的单碱基修饰。通过融合不同的Cas9和sgRNA和脱氨基酶结构域形成PAM靶点识别差异。这种方式相较来说产生效果较慢，有持续的替换过程，也有一定的脱靶风险。
目前改进的方向是加上部分ssDNA结合结构域达到高精度替换，或者使用高效的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂（UGI）降低非目标区编辑概率。第三种是原生编辑，原生编辑器直接通过一个逆转录酶和HNH受损的缺口酶Cas9（HA）组成，利用pegRNA导向，把特定DNA链替换成靶点特定DNA链，实现了完整的“寻找-替换”策略。目前这种策略在植物中运用较少，仍然需要更多转化事件来独立评估其安全性。
除了讨论具体的CRISPR技术，作者也讨论了基于这些技术在植物抗病领域的应用。包括通过多种方式对核结合富亮氨酸重复蛋白（NLR）进行修饰以增强对特定效应器或者更广谱病原菌的识别方式。作者也对未来抗病领域运用CRISPR基因编辑技术改良作物品种需要防范的风险和前景做了深入探讨，既用了在稻瘟病、小麦叶片铁锈病单碱基编辑的成功例子，也提出未来在植物抗病机理研究上有了更为深入的理解后利用原生编辑、碱基编辑及获得性抗性突变体筛选的方法，在不影响植物其他农艺性状的条件下进行设计育种。作者认为，目前的DNA递送方式（农杆菌转化、基因枪等）都有许多限制和副产物效应，如果躲避或者发展新的DNA递送方式才能真正释放CRISPR技术的全部潜力。
感谢此新闻稿的作者陈可博士对“MolPlant植物科学”
