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当我们通过高通量测序，拿到不同细胞亚型或实验对照组之间的差异表达的基因列表后，除了能对这一系列的基因进行富集分析，找出表达模块、互作网络，等等，我们还需对这些数据进行实验层面上的验证。一方面是佐证选定的标志基因都能在相应组别中找到，可以是荧光定量PCR，免疫组化，或原位杂交。另一方面，当证明了这些标志物的存在后，我们需要研究它们在特定组别中存在的生物学意义。有过报道的基因自然毋需过多的验证，但对于功能未知的基因，我们该怎么研究呢？
敲减（knockdown）
在我们对大量基因进行缺失功能后的筛选时，通常我们会选择更易于实现高通量的基因敲减法。这种研究策略的实质是利用互补RNA同目标序列结合后触发细胞中的RNA降解机制，并让目标基因的表达量降低，形成基因沉默效应，从而通过对比敲减后与敲减前的基因表达情况，推断未知基因的功能。尽管对于快速繁殖的细胞而言，我们可以直接通过基因合成将siRNA（小干扰RNA，通常20-25nt）转染至细胞内，但对于大多数缓慢扩增或原代细胞来说，稳定敲减是我们的首选方案。通常，我们会选用pLKO.1载体进行基因敲减实验。首先，我们设计一段shRNA（短发卡RNA），包括（1）AgeI-粘性末端；（2）siRNA正向序列；（3）环状结构；（4）转录终止区；（5）EcoRI-粘性末端：Fwd:5’CCGG-21bpsense-CTCGAG-21bpantisense-TTTTTG3’Rev:5’AATTCAAAAA-21bpsense-CTCGAG-21bpantisense3’网上有很多关于如何设计siRNA的教程，这里不再赘述。比较可靠的方法是直接使用BroadInstitute的网站设计这段序列，网址如下：