摘要
冠状病毒的核衣壳（N）蛋白在病毒组装和RNA转录中起着至关重要的作用。重要的是在核苷酸水平上对病毒进行表征，以发现病毒的基因组序列变化和相对于其他病毒的相似性，这些病毒可能会对其基因和蛋白质的功能产生影响。这需要全面和比较分析首选核苷酸感兴趣的病毒基因组、密码子偏倚、第3位（NT3s）的核苷酸变化、同义密码子的使用和相对同义密码子的使用。在本研究中，在核苷酸和氨基酸水平上分析了13种不同冠状病毒（CoV）中N蛋白的变化，试图揭示这些病毒相对于它们在N基因中的首选密码子使用如何适应它们的宿主。结果表明，总的来说，18个氨基酸具有不同的首选密码子，其中8个是过度偏倚的。其中N基因的AT%高于GC%，其有效密码子数量的值介于40.43~53.85之间，表明密码子存在轻微的偏差。中性图和相关分析显示，猪流行性腹泻CoV（pedCoV）的GC3s/GC相关性很高，其次是中东呼吸综合征-CoV（MERSCoV）、猪三角洲CoV（dCoV）、蝙蝠CoV（bCoV）和猫CoV（fCoV），r值分别为0.81、0.68、-0.47、0.98和0.58。这些数据意味着CoV基因组的高进化率和突变对CoVN基因进化选择有强烈的影响。这种类型的遗传分析将有助于评估病毒的宿主适应，进化，因此对疫苗设计策略有价值。
1、前言冠状病毒（covs）是一种包膜的正链RNA病毒，含有30kb的基因组和四种结构蛋白，即刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）(Siddelletal.,)。S蛋白调节病毒对目标宿主细胞上受体的附着(Cavanagh,)。E蛋白质的功能是组装病毒并充当离子通道（RuchandMachamer,）；M蛋白与E蛋白一起在病毒组装中发挥作用，并参与新病毒颗粒的生物合成（Neumanetal.，）；N蛋白与病毒RNA形成核糖核蛋白复合物（Riscoetal，）。N蛋白是一种多功能结构蛋白，具有增强病毒基因组转录、在病毒组装过程中与其他蛋白质（M蛋白）结合、通过破坏各种细胞活动而对宿主细胞产生毒性等不同特征(Berryetal.,;McBrideetal.,)。在COV的结构蛋白中，N蛋白是最保守和最稳定的蛋白；而S蛋白在病毒感染过程中经历了几个剧烈的变化。例如，它大的部分在感染时被细胞蛋白酶切割，并暴露出受体以激活病毒附着在宿主身上(Fiscus,;Wuetal.,a,b;Maacheetal.,;Gaoetal.,)。此外，S蛋白容易发生突变，特别是在与尖峰蛋白-细胞受体界面相关的氨基酸中，以克服宿主免疫反应(WuandYan,;Suietal.,)。在一项有趣的研究中，发现COV的N基因比S基因更有效地评估密码子的使用偏差(Ahnetal.,)。研究报告指出，由原核生物产生的N蛋白已被用来产生针对各种动物冠状病毒的特异性抗体，包括SARS(Loaetal.,;Timanietal.,;Wuetal.,a,b;Blanchardetal.,)。针对hCoVOC43的抗体抗兔多克隆的hCoVOC43重组抗原N蛋白，没有与其他冠状病毒发生交叉反应（SARSCoV和hCoVE）(Liangetal.,)。此外，在不同的老年人血清样品中进行了检测，由于N蛋白的有效中心部分（-个氨基酸），其次是C（-）和N（1-）的终端部分，其反应性很强(Leeetal.,;Yuetal.,;Liangetal.,)。因此，N蛋白作为hCoVOC43的敏感和特异性诊断工具（Dietal.,;Heetal.,），它在检测SARSCoV感染（感染第一天后）方面进一步发挥了作用（Cheetal.,）。对SARSCoV蛋白的类似研究报告了免疫优势区N1（1-氨基酸）和N3（-氨基酸）在Balb/c小鼠中产生特异性抗原，并与SARS患者的血清反应，因此可用作有效的SARSDNA疫苗（Duttaetal.,）。在重组浣熊痘病毒中表达的CoVN蛋白揭示了皮下注射预防猫传染性腹膜炎病毒感染的有效疫苗(Wasmoenetal.,)。
必须在密码子或核苷酸水平上研究病毒基因结构和组成，以揭示病毒-宿主关系和病毒进化的机制（Bahiretal.,;vanHemertetal.,）。有20个氨基酸由61个密码子编码，这意味着一个氨基酸可以由多个密码子编码。这些替代密码子，每个氨基酸多达6个密码子，被称为同义密码子（Nakamuraetal.,）。在基因到蛋白质翻译过程中，一些同义密码子优先于其他密码子。这被称为密码子偏差或密码子使用偏差。病毒基因和基因组可以根据宿主表现出不同数量的同义密码子（LloydandSharp，）。此外，病毒中密码子的使用受选择压力的影响，并且其组成约束由病毒宿主系统决定（Karniychuk，）。选择力作用于维持密码子偏倚和基因进化的基因序列（Ikemura,;SharpandLi,;Sharpetal.,）。密码子偏差有助于分析水平基因转移，也是研究基因分子进化的关键进化力量（Doolittle,;Ochmanetal.,;Woese,）。密码子偏差发生在蛋白质表达过程中，当存在相似的tRNA含量时，蛋白质基因中的密码子偏差将是相同的（Kanayaetal.,）。密码子偏差影响蛋白质的功能及其翻译效率(ChaneyandClark,;Supek,)。
本研究的目的是对13种不同CoVs的N基因进行综合分析，包括首选核苷酸、首选密码子、密码子偏倚和同义密码子的使用，并提供对这些病毒的密码子模式与其宿主和基因组进化关系的理解。
2、材料和方法2.1基因数据收集和分析程序
13种不同CoV的N基因，即猪流行腹泻冠状病毒（pedCoV）（），中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）（），传染性支气管炎CoV（ibCoV）（），骆驼α-冠状病毒（cCoV）（31），猪三角冠状病毒（dCoV）（74），可传播胃肠炎冠状病毒（tgCoV）（69），人冠状病毒E（hCoVE）（34），牛冠状病毒（bvCoV）（49），蝙蝠冠状病毒（bCoV）（34），人冠状病毒HKU1（hCoVHKU1）（36）、犬冠状病毒（caCoV）（40）、猫冠状病毒（fCoV）（40）以人CoV-OC43（hCoV-OC43）（）为研究对象。这个N个基因的编码序列及其登录号从GenBank数据库（补充文件）获得。CLCGenomicsWorkbench12.0(QIAGEN,Aarhus,Denmark)()(
