修饰引物探针系列详解STR探针

北京治疗白癜风最好十佳医院 http://m.39.net/pf/a_4487473.html
在上一期的栏目中,我们详细介绍了分子信标探针修饰引物/探针系列详解-分子信标探针,本期为大家带来的是STR探针,下面我们先介绍一下STR(shorttandemrepeat,短串联重复序列),它是基因组中由2-6个碱基单元组成的一段DNA重复序列,也称微卫星DNA(microsateiiite)或简单重复序列(SSR)。由于核心单位重复数目在个体间呈变异性并且数量丰富,因此STR具有高度多态性,最早发现STR是在真核生物基因组中,其广泛存在于真核生物基因组的编码区和非编码区中(Rogeretal.),STR作为一个重要的遗传标记系统,在基因定位、肿瘤分析、法医鉴定、亲权鉴定和遗传分析等多个领域应用广泛,以下为常见DNA重复序列家族成员特点比较(司艳梅)。

STR的特点

1.种类多、分布广,并按孟德尔共显性方式保持稳定遗传,比如在人类的基因组中,每50kb左右即存在重复序列,而且突变率低(0.04%)。

2.高度多态性,主要表现为同一物种不同个体的某个基因位点重复序列的重复频次可不一样,同一个体的两个同源染色体的重复次数也可以不一样,这就代表着STR的拷贝数在同一物种中是不唯一的。

3.遗传连锁不平衡现象,主要指多个基因座的等位基因同时出现在一条染色体上的几率,高于随机出现的频率。

4.可被转录,这些重复序列可以被转录,一部分可行使编码蛋白质的功能。

STR-PCR工作原理

STR-PCR是根据STR两端序列的保守性,设计特异性的引物,利用PCR扩增出每个位点的STR序列,通常扩增长度为~bp,随后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、毛细管电泳(CE)、二代测序进行产物检测。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE):该方法是传统方法,具有低成本、自主操作等优势,劣势为对凝胶浓度及实验水平有要求,结果精确度较低。

毛细管电泳(CE):该方法具有自动化程度高、检测通量高、数据读取精确等优势,是目前的主流检测平台,劣势为价格昂贵,需要具备毛细管电泳仪。该方法相比于传统的聚丙烯酰胺电泳加放射显影或银染的方法更快捷高效,准确度更高,且能同时进行多个位点的检测。

二代测序:该方法具有低样本量、高通量、较低成本等优势,劣势为应用范围较小,主要集中在法医鉴定,对于生物信息分析等数据分析水平有较高要求。

如果需要检测某样本两个不同STR位点的重复序列,应该如何进行设计呢?

图1STR位点示意图

分别在两个位点两侧的保守区域设计5’带荧光标记的引物(即STR探针),STR1选择HEX标记,STR2选择FAM标记。在同一个反应体系加入待测样本和两对STR探针进行PCR扩增后,扩增产物与内标混合后通过毛细管电泳获得检测峰图,不同峰型代表不同长度的扩增产物,通过Genemapper软件分析数据。结果显示等位基因上的STR1都具有8次重复序列,等位基因上的STR2分别具有9次和12次的重复序列。

图2STR检测结果示意图

STR探针的稳定性

荧光脱落指标记在探针上的荧光基团与引物间的链接断裂,荧光基团残基聚集形成大分子聚合物,在毛细管电泳检测时,除了正常的扩增产物峰,还会检测出非特异峰。荧光基团脱落会引起非特异性荧光信号。

图3为不同探针毛细管电泳检测的峰图,探针检测A图中除了探针与少量背景(正常现象)的峰外,无荧光脱落峰,另一探针检测B图存在荧光脱落(红圈标记),这个非特异的峰就是脱落的荧光基团聚合的大分子,所以在进行STR探针合成时,需选择合成工艺成熟和经验丰富的公司。

图3荧光脱落检测结果图

STR的应用

1.用于遗传标记,STR位点在基因组中分布均匀、多态位点丰富、检测便捷。

2.用于遗传性疾病的基因诊断,通过家系研究、运用连锁和相关分析可以找到与疾病高度相关的STR位点。

3.用于群体遗传学、考古学研究,通过研究其多态性,变异速率以及比较序列间差异、人群间差异,就可从分子生物学角度揭示人类的起源、迁徙、进化等历史进程。

4.用于法医学个体识别和亲权鉴定,对于很少量和较大降解的样本,推荐进行STR扩增鉴定。

5.用于器官移植,分析受者外周血,若含有供者STR类型,则说明成功植活。

6.用于细胞鉴定,已被CLAC、ATCC等作为细胞鉴定的金标准。

参考文献:

Roger,Miesfeld,Mark,etal.Amemberofanewrepeatedsequencefamilywhichisconservedthroughouteucaryoticevolutionisfoundbetweenthehumanδandβglobingenes[J].Nucl.AcidsRes,,9(22):-.

司艳梅.依赖于STR的法医学DNA分型技术研究进展[J].河南医学研究,,10(3):4.




转载请注明:http://www.bjgongshangzhuce.com/jyjg/9788.html


当前时间: