近十年来，晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗，尤其是靶向治疗，取得了极大的进展，可明显提高患者治疗的客观缓解率和延长无进展生存时间（PFS），并显著提高生活质量。分子分型是NSCLC实施靶向治疗的前提。
选择准确、快速、恰当的检测方法，全面筛选出适用靶向药物的目标人群具有重要临床意义。同时，随着少见基因变异的不断发现以及靶向药物获得性耐药机制的完善，临床对基因检测的内涵提出了更多的需求。
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分子病理检测的方法多样，包括Sanger测序、即时定量PCR（qRT-PCR）、荧光原位杂交（FISH）、二代测序（NGS）及免疫组织化学（IHC）等，各种检测方法具有不同的优缺点，需根据检测内容及临床需求选择恰当的检测方法。单基因检测是现阶段广泛获批的检测方法，具有快速、易开展的特点；多基因检测可一次为患者提供多种基因变异信息。现阶段，多重PCR检测和小Panel二代测序试剂盒均已经获得国家药品监督管理局（NMPA）的批准，可同时检测多个基因变异；二代测序技术能够在DNA及RNA水平进行更多基因、多位点检测，是未来分子病理的发展方向。
NSCLC基因变异检测主要包括靶向治疗及免疫治疗相关分子病理检测。我国NSCLC患者分子变异谱不同于西方人群，主要体现在腺癌，包括常见变异基因表皮生长因子受体（EGFR，45%～55%）、KRAS（8%～10%）、间变性淋巴瘤激酶（ALK，5%～10%），少见变异基因ROS1（2%～3%）、MET（2%～4%）、HER2（2%～4%）、BRAF（1%～2%）、RET（1%～4%），以及罕见变异基因NTRK（1%）、NRG1/2（1%）、FGFR2（1%）等。
免疫治疗相关分子病理检测包括PD-L1蛋白表达和TMB。其他生物标志物，如高度微卫星不稳定（MSI-H）在NSCLC中罕见。如何规范进行NSCLC患者基因检测，使得肺癌患者得到最佳的分层治疗方案，一直是临床医师努力的方向。笔者结合最新版《非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南(版)》进行归纳总结。
基因检测适用人群1、拟接受靶向治疗的肺浸润性腺癌（或包括含腺癌成分的NSCLC）。
2、经活检组织病理学证实为非腺癌的晚期NSCLC患者可推荐进行靶分子基因检测。除肺腺癌外，靶分子基因变异在其他NSCLC患者（如肺腺鳞癌、非特指NSCLC、大细胞肺癌及肺肉瘤样癌等）中真实存在，且患者可在靶向药物治疗中获益。
3、所有EGFR、ALK基因变异阴性晚期NSCLC患者，如拟进行PD-1/PD-L1抗体药物免疫治疗，推荐进行PD-L1表达检测。对拟实施抗PD-1/PD-L1免疫治疗的NSCLC患者，可选择进行TMB检测。
基因检测送检标本类型规范1、检测标本优先使用肿瘤组织石蜡标本：主要包括手术、纤维支气管镜下活检、CT引导下肺穿刺、胸腔镜、淋巴结穿刺活检等方法获取的标本。检测前需对肿瘤细胞比例进行评估，满足检测要求后方可进行检测。对于手术标本，优先选取肿瘤细胞比例较高的标本进行基因检测。若肿瘤细胞比例较低，可通过富集，以保证检测结果的准确可靠。
2、细胞学标本：包括胸腔积液、经皮肺穿刺活检、支气管内超声引导细针穿刺活检（EBUS-FNA）、痰、肺泡灌洗液等，需制作成石蜡包埋标本，进行肿瘤细胞比例评估，满足检测要求后可进行检测。
3、对于少数不能获得组织或细胞学标本的晚期肺癌患者，推荐血液检测（液体活检）。晚期NSCLC患者的血液中存在循环游离肿瘤DNA（ctDNA），其血浆中ctDNA有更高的检出率。
4、对于部分晚期发生脑膜转移的NSCLC患者，脑脊液对颅内肿瘤的ctDNA具有富集作用，可通过腰椎穿刺获取脑脊液进行相关基因检测。
不同突变基因检测规范1、EGFR
EGFR基因变异包括基因突变（点突变、插入/缺失突变），主要发生在编码EGFR酪氨酸激酶区的第18～21号外显子，以及获得性耐药突变（包括第一、二代TKI的耐药突变TM和第三代TKI的耐药突变CS等）。
EGFR基因突变常用检测方法及位点要求：目前EGFR基因突变检测的方法有很多种，临床常用的检测方法包括Sanger测序法、qRT-PCR法和二代测序等。不管使用何种检测方法，均应包括EGFR最主要的突变位点外显子19缺失（19del）和外显子21点突变（LR），还应包括外显子18点突变（GX），外显子20插入突变（20ins）和点突变（TM、SI），外显子21点突变（LQ）等。
不同检测手段的优缺点
Sanger测序法
是直接可检测已知和未知突变的一种方法，是早期广泛应用的EGFR基因突变检测方法。但Sanger测序法检测EGFR基因突变的灵敏度较低，操作步骤复杂、容易产生污染，已不能完全满足临床EGFR基因突变检测的需求。
qRT-PCR
基于qRT-PCR的方法，需要根据EGFR基因已知的突变类型设计引物探针，无法检测出所有可能的突变，但灵敏度相对较高，操作简单，无需对PCR产物进行操作，在很大程度上避免了扩增产物的污染，易于在临床开展，是目前EGFR基因突变检测最常用的检测技术之一。
二代测序
二代测序是一种高通量测序技术，能够同时对多基因、多位点进行测序。相较于传统测序技术，二代测序可以一次性检测大量靶基因，能够分析基因变异的丰度，相对成本低。然而二代测序操作步骤多、程序复杂，任一环节出现问题，都会影响检测结果的准确性，结果的判读依赖生物信息的准确分析。二代测序检测EGFR基因突变，检测位点更加全面，可以发现罕见突变位点，为晚期NSCLC患者的全流程管理提供依据。
耐药机制检测
目前EGFRTKI的耐药机制已经基本明确，大部分是由EGFRTM的获得性突变，约占50%。其他机制包括MET基因扩增、KRAS突变、BRAF突变等。因此，对于第一、二代EGFR-TKI耐药患者，优先推荐进行TM检测（qRT-PCR或二代测序）。也可同时与其他耐药机制进行检测或TM检测阴性后用高通量技术（二代测序）进行其他耐药机制的检测。第三代TKI耐药患者，推荐进行二代测序检测耐药机制。
2、ALK
ALK基因变异类型包括基因重排/融合，以及获得性耐药突变（点突变为主）。ALK激酶区的获得性突变是ALK抑制剂治疗耐药的主要机制之一，对指导耐药患者的后续临床治疗具有一定的指导意义。
ALK基因变异常用检测方法及主要特点：ALK基因重排导致ALK融合基因的表达，可以在多个分子水平上进行检测，包括FISH在DNA水平上检测ALK基因重排；qRT-PCR检测ALK融合mRNA；IHC检测ALK融合蛋白表达，以及二代测序检测DNA水平上的重排序列或mRNA水平上的融合序列。
不同检测手段的优缺点
ALKVentanaD5F3IHC检测
是目前最快速、经济的方法，并且二元结果判读标准简便易行。该判读标准仅适用于肺腺癌，该检测在用于鳞癌、神经内分泌癌等其他类型肺癌标本时应谨慎，疑似阳性标本需要使用其他方法进行验证。在临床实践中要警惕IHC结果判读中存在的陷阱，避免非特异性着色。
FISH检测
是检测ALK重排的「金标准」，检测结果判读直观，对样本质量要求较低，但费用较高、经济效益比不佳。并且在FISH判读时，对于处于临界值分离信号、不典型分离信号等的判定需要格外谨慎，推荐利用其他技术平台复核检测。
qRT-PCR
基于qRT-PCR方法的ALK融合基因检测具有较高的灵敏度和特异度，但因为qRT-PCR只能检测已知ALK融合基因类型，所以存在假阴性。另外，由于qRT-PCR基于mRNA扩增技术，因此实验室内、外部质控等应制定最严格的技术标准，防止污染。
二代测序
二代测序可在血液中检出ALK基因变异，但应注意假阴性结果的出现，必要时选择其他平台或检测手段进行复测。
3、ROS1
ROS1基因变异包括ROS1基因重排。目前共发现十余种ROS1基因融合伴侣，主要包括CD74、SLC34A2、CCDC6、TPM3、EZR等，其断裂位点主要位于ROS1基因的第32～36号外显子。
ROS1基因检测方法及主要特点：
ROS1基因重排/融合表达检测各种方法学与ALK相似，但IHC抗体特异性不佳，目前不能直接用于检测ROS1基因重排/融合表达，仅可用于ROS1基因融合初筛。
基于qRT-PCR方法的ROS1融合基因检测具有较高的灵敏度和特异度，且可与ALK联检。
FISH检测是检测ROS1重排的「金标准」。
二代测序检测ROS1基因变异同样可在DNA水平上检测重排序列，也可在mRNA水平检测融合序列，但由于ROS1基因序列的特殊性，基于DNA水平的二代测序检测灵敏度受文库探针设计及生物信息学分析能力影响较大，应注意假阴性。
4、MET
在NSCLC的临床实践中，根据已有的循证医学证据，目前主要
