基因编辑有着纠正DNA突变的潜力，并可能治疗或消除无数人类遗传疾病。基因编辑的目标是以单个碱基精度改变细胞的DNA。首个使用基因组编辑的试点人体试验在HIV/AIDS患者中进行，靶向白细胞蛋白CCR5，目标是通过非同源重组使基因突变，从而对HIV感染诱导抗性。CRISPRC-Cas9可掺入多个引导序列，在哺乳动物基因组内的几个位点进行多重基因组工程。CRISPR促进高效多重基因组编辑的能力极大地扩展了可能的靶向遗传操作的范围，实现了在单轮突变中同时缺失或插入多个DNA序列等新的可能性。利用CRISPR工程治疗遗传性血液疾病和失明等一系列疾病的前景正在向现实靠拢。CRISPR-Cas9技术的最新进展也允许在人类T细胞中进行高效的DNA修饰，这为增强癌症治疗的效果带来了巨大的希望。
T淋巴细胞处于现代癌症免疫治疗革命的核心。T细胞受体(TCR)复合物位于T细胞表面，通过识别与MHC分子结合的外源抗原/肽成功实现抗肿瘤反应。癌症免疫疗法最有前途的领域之一就是过继细胞疗法，患者自己的T细胞经过基因工程改造，表达一种可以特异性检测和杀死肿瘤细胞的合成（转基因）TCR。最近的研究表明，在骨髓瘤、黑色素瘤和肉瘤患者中使用免疫原性NY-ESO-1肿瘤抗原特异性转基因TCR的过继性T细胞转移方法具有良好的安全性和疗效。在临床研究中，在转导了CAR的人T细胞中CRISPRC-Cas9介导的PDCD1破坏增加了肿瘤移植瘤的抗肿瘤疗效。癌抗原NY-ESO-1特异性转基因TCRT细胞过继转移，联合靶向PD-1的单克隆抗体，增强了小鼠的抗肿瘤疗效。作者因此设计了一项首次人体、I期人体临床试验，以测试多重CRISPR-Cas9基因组编辑用于合成生物学癌症免疫治疗应用的安全性和可行性。选择靶向T细胞上的内源性TRAC、TRBC和PDCD1，以增加NY-ESO-1TCR表达工程细胞的安全性和有效性。原则上，该策略允许增加外源性TCR表达并减少混合异源二聚体形成的可能性（即通过分别删除α和βTCR结构域基因TRAC和TRBC），并限制检查点配体PD-L1和PD-L2可触发的T细胞耗竭的发展。
相关研究于年2月6日发表在《Science》期刊，由宾夕法尼亚大学EdwardA.Stadtmauer博士所在科研团队完成，题目为CRISPR-engineeredTcellsinpatientswithrefractorycancer。文章通讯作者说“从参与该临床试验的前三名患者获得的数据证明了两个重要的事情，首先，我们可以在制造过程中成功地进行多次精确编辑，从而使它们在细胞中存活更长的时间。第二，迄今为止这些细胞已显示出持续的攻击和杀死肿瘤的能力，这是前所未有的！”
首先，I期人体试验被设计用于评估患者在CRISPR-Cas9编辑TRAC、TRBC和PDCD1位点后输注自体NY-ESO-1TCR工程化T细胞的安全性和可行性。从癌症患者体内取出细胞，进行工程化处理，然后回输到个体体内。基因工程T细胞产物被称为NYCE（NY-ESO-1转导的CRISPR3X编辑细胞），以下简称为NYCE。在方案的临床开发过程中，作者选择使用TCR而不是CAR，因为使用TCR时细胞因子释放综合征的发生率通常较低。原则上，这使得当与在作者以前的靶向NY-ESO-1与转基因TCR的临床试验中观察到的基线低水平不良事件相比时，更有区分性评估Cas9基因编辑是否具有潜在的免疫原性或毒性。
通过电穿孔核糖核蛋白复合物(RNP)生产T细胞产品，包括重组Cas9装载等摩尔的sgRNA混合物，用于TRAC、TRBC和PDCD1，然后慢病毒转导转基因TCR所有产品扩展至收获时1*个T细胞。通过V8.1流式细胞染色或右旋糖酐染色可检测到转基因TCR，最终产品中有2~7%的T细胞。通过数字PCR确定的编辑频率因sgRNA而异，TRAC、TRBC和PDCD1分别约为45%、15%和20%。
通过与设计表达NY-ESO-1的HLA-A2肿瘤细胞共培养，评估最终工程化T细胞的效力。工程T细胞在广泛的效应细胞和靶细胞比例中具有强大的抗原特异性细胞毒性。有趣的是，用CRISPR-Cas9处理的细胞比用TCR转导但没有CRISPR-Cas9电穿孔的对照细胞（即保留内源性TCR的细胞）更具细胞毒性。这与以前在小鼠T细胞中的发现一致，当一个转基因TCR被插入到内源性位点，消融内源性TCR的表达。需要进一步研究来确定PD-1基因敲除是否有助于提高内源性TCR基因敲除所提供的效力。作者开发了一种灵敏的免疫测定法，用于检测化脓性链球菌Cas9蛋白，并在生产过程早期对Cas9进行定量，结果显示在收获的最终产物中每个细胞小于0.75fg/cell的细胞水平下降。使用竞争性荧光ELISA筛查，作者发现健康供体对血清和T细胞中的Cas9具有体液反应性，证实了之前的报道。有趣的是，作者发现在输入工程化T细胞后的不同时间点检测的三例患者对Cas9没有产生体液反应。Cas9免疫的缺乏与输入细胞的延长持久性一致，可能是由于输注产物中Cas9含量低，或者是患者由于其广泛的既往治疗史导致的免疫缺陷的结果。
对三名晚期难治性癌症患者输注CRISPR-Cas9工程化T细胞。输注耐受性良好，无严重不良事件。重要的是，无细胞因子释放综合征病例，这是一种与癌症免疫疗法相关的潜在危及生命的全身炎症反应。三例患者均输注1*个细胞/kg，由于TCR转导效率存在相当大的差异，输注的工程化T细胞的绝对数量范围为6*-7.1*个细胞。尽管工程细胞存在变异，但所有三例患者血液中的工程细胞均存在较高的峰值水平和持续持久性。转导细胞的持久性在输注后3-9个月非常稳定，从每升血液中5-50个细胞不等。作者设计的T细胞的稳定植入与以前报道的NY-ESO-1设计的T细胞的试验有显著的不同，NY-ESO-1设计的T细胞在血液中的半衰期是1周。骨髓瘤患者的骨髓和肉瘤患者的肿瘤活检标本证明，所有3例患者的工程T细胞均以接近血液室水平的方式转运至肿瘤。为了确定CRISPR-Cas9基因编辑细胞的植入频率，作者最初使用了基于芯片的数字PCR。在本试验中，所有三例患者的TRAC和PDCD1位点编辑细胞植入均明显。患者UPN39和UPN07中的TRAC和PDCD1编辑持续存在。TRBC编辑细胞的低水平植入很可能与在作者的临床前研究中观察到该位点的编辑效率水平最低有关。
生产过程中使用的三种sgRNA预计靶上和脱靶切割的分布会有所不同。在三种sgRNA中，TRBC的脱靶突变比其他位点更多。用于rnPDCD1特异性最强，因为在超过个剪切位点中鉴定出极少的脱靶编辑，在TRAC1和TRAC2位点鉴定出极少的脱靶Reads。鉴于3个靶向基因在2、7和14号染色体上的染色体定位，确定的DNA裂解位点的基因组定位与预期一致。对于TRACsgRNA，CLIC2的转录单位（细胞内氯离子通道2）内存在低丰度突变；然而，预计T细胞中CLIC2的破坏不会产生不良后果，因为其未报告在T细胞中表达。在编码转录调节因子(ZNF)和长基因间非蛋白编码RNA(LINC)的基因中发现了脱靶编辑。CRISPR-Cas9工程化T细胞中染色体易位的检测除了通过NHEJ检测双链DNA断裂的修复外，工程化核酸酶的在靶突变可导致缺失、重复、倒位和易位，在某些情况下还可导致复杂的染色体重排。在人T细胞的临床前研究中，利用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)同时对TRAC和CD52进行基因编辑，导致易位。
作者使用单细胞RNA测序(scRNAseq)全面表征了NYCET细胞的转录组表型及其在患者UPN39中随时间的进化。选择UPN39是因为其具有最高的细胞植入水平，并且该患者有肿瘤消退的现象。CRISPR-Cas9工程化T细胞被输注到患者UPN39中，在第10天(D10)和第4个月(D)从血液中输注后恢复，并通过scRNAseq进行分析，从基因表达文库中，PCR用于进一步扩增NY-ESO-1TCR转基因对应的细胞cDNA，以及TRAC、TRBC和PDCD1靶序列，使作者能够对野生型或突变型单细胞进行基因分型。识别出了所有三个靶序列中含有突变的细胞。最常见的突变基因为TRAC。大约30%的细胞未识别出突变，而约40%的细胞存在1处突变，生产产品中分别有20%和10%的T细胞在靶序列处发生双突变和三突变。输注产品中转基因TCR细胞的单基因突变频率低于双基因突变和三基因突变。输注后10天和4个月UPN39细胞的单细胞基因分型显示，从输注产品中的水平来看，基因编辑T细胞的频率下降，这种下降发生在无论细胞是否转导NY-ESO-1TCR的情况。基因编辑细胞的频率在输注后第10天和第4个月之间相当稳定，值得注意的是，该患者在输注后4个月的外周血循环T细胞中大约有40%在任何一个靶基因上发生了突变。
特别令人感兴趣的是PD-1缺陷T细胞的频率和进化，由于前面提到CAR和TCRT细胞中PDCD1的遗传破坏增强了临床前模型中的抗肿瘤疗效。作者发现，在输注产物中表达NY-ESO-1TCR的T细胞中，约有25%的PDCD1位点发生了突变。有趣的是，在输注后4个月，在PDCD1位点有编辑的细胞频率下降到表达转基因TCR的细胞的5%。这与慢性感染的小鼠研究一致，其中PD-1缺陷T细胞不太能够建立记忆。表达NY-ESO-1TCR转基因的患者体内工程化T细胞的分布随时间的变化，这些细胞从输注产品演变而来，然后在体内4个月再次演变而来。值得注意的是，该患者中央记忆相关基因(IL7R、TCF7)的表达随时间增加。这与最近发表的NYESO-1T细胞在没有基因组编辑的情况下的结果形成了鲜明对比，在这种情况下，输注的转基因T细胞进化为终末分化的表型，并在癌症患者中表现出T细胞衰竭的特征。
临床观察三例输注的癌症患者的临床过程中。无患者出现细胞因子释放综合征或细胞输注引起的明显副作用。临床反应为两例患者病情稳定。UPN39有混合反应，腹部大肿块减少约50%，持续4个月，尽管其他病变进展。截至年12月，所有患者均出现进展：两例患者正在接受其他治疗，UPN07死于进展性骨髓瘤。三例患者的骨髓和肿瘤活检均显示NYCE改造的T细胞迁移至肿瘤部位。值得注意的是，尽管肿瘤活检显示有残余肿瘤，但在两例骨髓瘤患者中，靶抗原NY-ESO-1和/或LAGE-1均减少。为了确定NYCE细胞在输注后是否保留了抗肿瘤活性，在存在NYESO-1肽的培养物中扩增输注后3至9个月从患者获得的血样，并评估对肿瘤细胞的细胞毒性。三例患者均出现抗原特异性细胞毒性。值得注意的是，在UPN39中观察到了最有效的抗肿瘤细胞毒性，因为UPN39是输注CRISPR-Cas9工程化T细胞后出现肿瘤消退的唯一患者。
总之，作者的I期研究已经证实，人类基因组的多重CRISPR-Cas9编辑在临床规模上是可能的。虽然最初的临床结果是安全的，但需要更多的患者使用具有更高的编辑效率和输注后更长的观察时间的经验来充分评估这种方法的安全性。预先存在的对Cas9的免疫反应而导致的对输注细胞的潜在排斥似乎并不妨碍这种有前途的技术的应用。
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