比CRISPR更新的基因编辑技术N

导读

ComparingCas9toNgAgo:CantheArgonautesBestCRISPR?

生物学家将为一个最新的基因编辑蛋白而疯狂---裂解DNA的Argonaute蛋白，简写为NgAgo，该蛋白来源于格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacteriumgregoryi）。

Addgene已经向全世界分发了该质粒nls-NgAgo-GK(Plasmid#)，那么每个人心中的问题是：NgAgo是否能够取代CRISPR？这样的转变不会在一夜之间发生，但有几个原因，或许会让你选择NgAgo而不是CRISPR蛋白Cas9或Cpf1。

Background:ArgonauteandNgAgo

在真核生物中，Argonaute蛋白在RNA干扰中发挥着重要作用，可以通过结合RNA来指导切割外来的RNA。Argonaute蛋白也存在于原核生物中，其中一些蛋白质可以防止DNA的入侵。在斯瓦茨等人，鉴定了来自（Thermusthermophilus，TtAgo）的Argonaute蛋白，表明该蛋白在体外能够通过磷酸化DNA来指导切割DNA。不过斯瓦茨等人，无法证明在哺乳动物细胞中TtAgo介导的切割的存在，可能是受限于高温度的要求。

为了解决这个问题，高峰（第一作者，通讯作者为河北科技大学的韩春雨）等人，寻找TtAgo和另一个嗜热蛋白PfAgo的类似Argonaute蛋白。他们发现了NgAgo，并发现它可以在很多哺乳动物细胞系中切割质粒和基因组DNA，其切割效率类似于Cas9。类似于Cas9，NgAgo也能够在存在模板的情况下，介导同源直接修复。

Cas9andNgAgoHeadtoHead

NgAgo有很多与Cad9不同的独特的特征，这些包括：

与Cas9和其他CRISPR酶不同，NgAgo不需要PAM序列，因此使用者在基因组目标的选择上有更多的灵活性。NgAgo在富含GC区域的作用也比Cas9更好。

NgAgo用5’磷酸化的DNA来作为向导（所谓的“gDNAs”）而不是像Cas9或Cpf1那样用RNA来引导。简单的说，24个碱基的DNA作为向导可能对使用者更友好，因为它们可以被以寡核苷酸的形式订购，而且在细胞中稳定存在。gDNA向导也需要转染到感兴趣的细胞中。相反，向导RNA必须用质粒或体外转录表达，并且gRNA二次结构的变化会影响编辑效率。高峰等人，用为10个基因设计的5个向导/基因测试了NgAgo是否会偏好某些特定的引导序列，他们在切割效率上没有观察到什么差异。如果这一发现可以在大范围研究中被复制，这将是一个比Case9技术更优势的关键点，因为gRNA可以极大地影响编辑效率。

长度上只有个氨基酸，NgAgo比SpCas9（AA），SaCas9（AA），或Cpf1（取决于物种，AA或AA）更小。如果你在对小容量的病毒载体，如腺病毒进行相关研究，那么这个特征是很有利的。

RNA引导的CRISPR酶导致双链断裂，裂解成平端（Cas9）或粘性末端（Cpf1）。NgAgo采取了不同的方式，在gDNA指定的裂解位点随机去除1-20个核苷酸。这可能是有利的或不利的，取决于你的应用。在自然环境下，碱基切除有助于防止入侵的基因组“恢复”其原始序列。如果你想通过碱基的插入和删除来破坏基因的功能，这个属性可以是一个优势。然而，在碱基切除后修复时会改变目标序列，阻碍未来的HDR（同源直接修复），这可能会降低HDR效率。

需要更多的研究来比较CRISPR和NgAgo，但似乎NgAgo具有更低的潜在脱靶效应。在高峰等人的实验中，在向导DNA的任何位置的一个碱基错配都会影响NgAgo的活性，而三个碱基的错配会直接导致其活性丧失。

NgAgo向导加载的出现局限于蛋白质合成的有限期间内，所以NgAgo仍然忠实于它的向导DNA，不能随意更换向导。而这种忠诚会阻止其他小DNA结合NgAgo，这可能会导致很难使用NgAgo破坏多个目标。

References

1.Gao,Feng,XiaoZ.Shen,FengJiang,YongqiangWuChunyuHan.“DNA-guidedgenomeeditingusingtheNatronobacteriumgregoryiArgonaute.”NatBiotechnol.EpubMay2.PubMedPMID:.

2.Swarts,DaanC.,etal.“DNA-guidedDNAinterferencebyaprokaryoticArgonaute.”Nature.()():-61.PubMedPMID:.PubMedCentralPMCID:PMC.

3.Swarts,DaanC.,etal.“ArgonauteofthearchaeonPyrococcusfuriosusisaDNA-guidednucleasethattargetscognateDNA.”NucleicAcidsRes.43(10)():-9.PubMedPMID:.PubMedCentralPMCID:PMC.

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