棉花响应烟粉虱胁迫的分子机制及棉花体细胞胚胎表观基因组学研究
Molecularmechanismofcottoninresponsetowhiteflyiffstationandepigenomicsbasisofcottonsomaticembryogenesis
作者：李健英
指导老师：金双侠教授
学院：植物科学与技术学院
专业：作物遗传育种
研究背景棉花作为全球三大转基因作物之一，其纤维品质和产量受到农业害虫的影响。随着转Bt基因棉花推广，鳞翅目害虫棉铃虫、红铃虫得到控制，但其抗性逐渐丧失。烟粉虱(Bemisiatabaci)等刺吸式口器害虫对全球棉花生产造成了巨大的危害，但关于棉花如何感知和防御烟粉虱的信息是非常有限的。
研究目的及意义陆地棉是异源四倍体(2n=4x=52,AADD)，基因组大小为2.4Gb，包含两个亚基因组At和Dt，有复杂的基因组结构且重复序列高。目前生产上推广栽培棉花品种为陆地棉，长期以来被认为是可再生纺织纤维重要资源，但棉花经常遭遇病虫害威胁。在过去20年，Bt转基因棉花已经成功控制棉铃虫、红铃虫等鳞翅目类害虫，但Bt转基因棉花并不能抵御烟粉虱、蚜虫、盲蝽蟓等刺吸式口器害虫。因此，挖掘棉花内源抗虫基因，解析棉花与刺吸式害虫互作的分子机制具有重要意义。在本研究中，以高抗烟粉虱棉花材料HR和高感ZS进行不同时间点烟粉虱侵染，分析抗感棉花材料在响应烟粉虱转录变化，结合公共发表的植物-害虫互作数据，初步分析了植物与害虫互作、植物激素转导、次生代谢产物合成和生物胁迫差异表达的基因。我们也构建了棉花受烟粉虱诱导后非编码RNA和小RNA转录谱数据，初步分析了非编码RNA和小RNA在棉花抗虫响应中的特征和表达，实验验证了lincRNA-miR-tasiARFs转录反应在棉花抗虫免疫和生长中的平衡作用。在基因组水平上，通过对来自全国三大棉区份核心资源材料进行了棉花田间抗虫性调查与评价，用高密度SNP数据和棉花抗性指数关联挖掘棉花抗虫重要位点，为棉花抗虫育种提供了重要候选基因资源及基础材料，这些分析为植-虫互作提供了丰富转录组和基因组数据资源。
另外一个研究，以年以后选育且农艺性状较好的棉花主栽品种Y为研究对象，经过连续再生驯化提高棉花的转化效率策略,获得了高遗传转化效率的材料，我们把它命名为Jin（转化效率约20%-25%）。为了研究SRA和体细胞胚胎发生表观遗传机制，系统研究了棉花再生和细胞分化DNA甲基化动态变化，棉花愈伤组织低甲基化利于体细胞胚胎发生相关基因的激活，进而提高植物再生能力。Jin优良受体材料的鉴定将会为棉花功能基因研究提供新的重要的支撑材料，丰富了对植物再生过程中DNA甲基化分子机制的认知，为提高植株再生效率提供可行的策略，对于改善低再生效率其他植物具有重要意义。
主要研究内容本研究分两大部分内容，分别探讨棉花内源的抗虫基因鉴定和功能分析以及棉花再生DNA甲基化图谱。
主要创新点及结论在本研究中，以高抗烟粉虱棉花材料HR和高感ZS进行不同时间点烟粉虱侵染，分析抗感棉花材料在响应烟粉虱转录变化，结合公共发表的植物-害虫互作数据，初步分析了植物与害虫互作、植物激素转导、次生代谢产物合成和生物胁迫差异表达的基因。我们也构建了棉花受烟粉虱诱导后非编码RNA和小RNA转录谱数据，初步分析了非编码RNA和小RNA在棉花抗虫响应中的特征和表达，实验验证了lincRNA-miR-tasiARFs转录反应在棉花抗虫免疫和生长中的平衡作用。在基因组水平上，通过对来自全国三大棉区份核心资源材料进行了棉花田间抗虫性调查与评价，用高密度SNP数据和棉花抗性指数关联挖掘棉花抗虫重要位点，为棉花抗虫育种提供了重要候选基因资源及基础材料，这些分析为植-虫互作提供了丰富转录组和基因组数据资源。另外一个研究，以年以后选育且农艺性状较好的棉花主栽品种Y为研究对象，经过连续再生驯化提高棉花的转化效率策略,获得了高遗传转化效率的材料，我们把它命名为Jin（转化效率约20%-25%）。为了SRA和体细胞胚胎发生表观遗传机制，系统研究了棉花再生和细胞分化DNA甲基化动态变化，棉花愈伤组织低甲基化利于体细胞胚胎发生相关基因的激活，进而提高植物再生能力。Jin优良受体材料的鉴定将会为棉花功能基因研究提供新的重要的支撑材料，丰富了对植物再生过程中DNA甲基化分子机制的认知，为提高植株再生效率提供可行的策略，对于改善低再生效率其他植物具有重要意义。
本研究主要结果如下：
1.棉花-烟粉虱互作转录组分析
利用RNA-Seq比较了烟粉虱强抗性品种（HR）和敏感性品种（ZS）在不同侵染时间点转录组差异。功能富集分析表明棉花对烟粉虱侵染的转录反应涉及编码蛋白激酶、转录因子、代谢物合成和植物激素信号的基因。结合GO和KEGG富集分析，HR和ZS感染烟粉虱后抗性基因的转录水平不同。RNA-Seq数据集构建的加权基因共表达网络显示WRKY40和铜转运蛋白是棉花响应烟粉虱侵染的枢纽基因。通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）研究GhMPK3，抑制了MPK-WRKY-JA通路，增强烟粉虱的易感性。本研究为棉花防御烟粉虱响应提供了全面见解，并鉴定了几类控制韧皮部害虫的候选基因。
2.棉花响应烟粉虱非编码RNA分子机制解析
本研究我们构建了抗性材料（HR）和易感材料（ZS）在烟粉虱侵染下小RNA和降解组测序。总共鉴定出个miRNA家族和个靶标。定量PCR分析显示几种miRNA及其相应的靶标呈现出动态的时空表达模式。在RNA-Seq数据集鉴定了2,个基因间区长链非编码RNA(lincRNAs)。进一步分析发现29个lincRNA转录本中产生17个miRNA前体。全基因组分析鉴定出85个同相位干扰小RNA（phasiRNA）位点，9个PHAS基因由6个miRNA触发，包括编码富含亮氨酸重复序列（LRR）的抗病蛋白，生长素响应因子（ARF）和MYB转录因子。通过构建模型和实验数据，我们探索和扩展了miR-tasiARF在棉花响应烟粉虱侵染转录调控机制。VIGS沉默ARF8增加了生长素和茉莉酸，导致对烟粉虱侵染耐受性增加。通过对不同的非编码RNA进行综合分析，为植虫互作提供了有用的转录组数据资源。
3.关联分析挖掘棉花抗虫位点
本研究收集了份陆地棉材料组成的自然群体，鉴定了2.88百万SNPs并进行群体进化树，群体结构，PCA分析和连锁不平衡分析。份棉花材料在三个环境中进行棉花四个抗虫指数调查，叶片危害率（LDR），整体植株危害率（PDR），感抗等级（SRL）以及盲蝽蟓指数（MI）。我们在三个环境下鉴定了7个LDR，PDR和SRL显著候选位点，其中有一个位点共定位。结合LD分析，整合转录组数据，筛选了一个铜转运子CRC1候选基因。
4.多组学数据揭示棉花再生和体细胞胚发育表观基因组学基础
本研究通过连续再生驯化（SRA）策略，从母体自交系Y中选育出具有高再生能力的优质棉花Jin。我们构建了体细胞胚胎发育过程中的非胚性愈伤组织（NEC），胚性愈伤组织（EC），体细胞胚（SE）以及再生后代植株的叶片全基因组单碱基分辨率甲基化图谱。结果表明，Jin显示出低DNA甲基化，再生后代中整体甲基化呈下降趋势。在NEC到EC中DNA甲基化上升由RNA介导的DNA甲基化（RdDM）和H3K9me2途径协同调控。在EC到SE中DNA甲基化下降，24-ntsiRNA和H3K9me2丰度不变，进一步分析发现DNA去甲基化酶ROS1和DME显著上调，该过程可能依赖于DNA去甲基化途径。整合RNA-Seq和差异甲基化区域（DMR），体细胞胚胎发生过程中低CHH-DMR激活了生长素和WUSCHEL相关基因表达。在NEC中添加DNA甲基化抑制剂增加了胚胎的数量。我们多组学数据为植物组织培养和再生后代植物中DNA甲基化的动态提供了新的见解。该研究还表明诱导的低甲基化可以更好的促进植物再生能力并优化母本遗传栽培品种。
代表性创新成果1.JianyingLi,MaojunWang,YajunLi,QinghuaZhang,KeithLindsey,HenryDaniell,ShuangxiaJin*,XianlongZhang.()Multi-omicsanalysesrevealepigenomicsbasisforcottonsomaticembryogenesisthroughsuccessiveregenerationacclimationprocess.PlantBiotechnologyJournal,17,-.
2.JianyingLi#,HakimManghwar#,LinSun#,PengchengWang,GuanyingWang,HanyanSheng,JieZhang,HaoLiu,LeiQin,HangpingRui,BoLi,KeithLindsey,HenryDaniell,ShuangxiaJin*,XianlongZhang.()Wholegenomesequencingrevealsrareoff-targetmutationsandconsiderableinherentgeneticor/andsomaclonalvariationsinCRISPR/Cas9-editedcottonplants.PlantBiotechnologyJournal,17,-.
3.JianyingLi#,LizhenZhu#,JoeHull,SijiaLiang,HenryDaniell,ShuangxiaJin*,XianlongZhang.()Transcriptomeanalysisrevealsa
