这是“师生活”的第篇原创文章，欢迎转发分享。这里有一群正在做教育和准备做教育的人，分享对职业和生活的点滴灵光。随着科学技术的发展，人类对基因奥秘的探索也越来越深入，除了科学家们在实验室的探索，普通人也对基因的故事充满了好奇心，剧作家和电影人们就抓住了读者和观众的这种心情，创作了不少基因相关的科幻故事。大家耳熟能详的《蜘蛛侠》、《阿凡达》都是好莱坞科幻电影中的基因科技的有力代表。今天想和大家分享另外一部电影：《千钧一发》（又名变种异煞），故事的背景是在不久的未来，通过编辑出生的人才是正常人，而自然分娩的孩子则被视同“病人”。除非有一些意想不到的非基因因素出现，人的生老病死都能够通过基因推断。男主角文森特就是一个“病人”，他一出生就被宣布带有一定的基因缺陷，长大后的他将是近视和心脏病患者，更可怕的是：根据基因推断，他只有30年的生命，而文森特的弟弟是一个基因编辑后的“正常人”。但文森特却非常想参加由遗传精英(“正常人”)组成的戛塔卡公司，因为那样才能参加前往“迪坦"星的太空旅行。一筹莫展之时，文特森认识了因事故导致瘫痪的“正常人”杰罗姆·莫诺，他想用莫诺的的血样和尿样报名参选……故事由此展开。图1《千钧一发》电影图片虽然这只是一部迎合大众口味的科幻电影，但是基因编辑技术确实存在，并且正在蓬勃兴起。基因编辑技术是一种可以在基因组水平对DNA进行遗传改造的操作技术，通过该技术能够实现对特定DNA片段的敲除、插入。目前应用比较广泛的基因编辑技术已经走过了三代，第一代的锌指核酸酶（zinc－fingernucleases,ZFNs）技术、第二代的转录激活因子样效应物核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALENs)和现在应用最为广泛的第三代CrisprCas9技术。
ZFNs技术
最初进行模式动植物实验和首次临床试验的基因编辑技术是ZFNs。ZFNs是zinc-fingernucleases的英文缩写，中文翻译为锌指核酸酶，它由人工构建的锌指蛋白(zincfingersproteins,ZFPs)的DNA结合结构域和非限制性核酸酶FokⅠ的切割结构域两部分组成，是一类真核生物中普遍存在的基因转录调控因子。锌指蛋白及作用机理
构成锌指核酸酶的一个重要部分是锌指蛋白，顾名思义，它是含有通过结合Zn2+的可以自我折叠形成"手指"结构的一类蛋白质，根据其保守结构域的不同，可将锌指蛋白主要分为C2H2（Cys2-His2）型、C4型和C6型，其中C2H2（Cys2-His2）型锌指蛋白在转录调控因子中广泛存在，锌指蛋白上有多个锌指结构域。年，米勒[2]等人最早发现并阐述了C2H2型锌指结构域的功能，每个锌指结构域中8位和13位的半胱氨酸(cysteine,Cys)以及26和30位的组氨酸(histidine,His)非常保守，他们络合锌离子形成稳定的指形结构，并折叠成α-β-β二级结构[3]，单个ZFNs包括三个锌指结构域和核酸酶，每个指识别大约3bp的DNA，因此单个ZFNs可结合一个9-bp的靶点，这使得ZFN二聚体(活性物种)能够指定每个裂解位点的DNA长度为18bp的串联序列（如图2）。当两个单体识别的DNA位点相距合适的距离时(6~8bp)，两个锌指酶单体产生酶切功能，从而对DNA双链产生剪切并引起靶位点DNA双链断裂。而真核细胞DNA修复机制能够在DNA双链断裂位置进行非同源末端连接或同源重组，从而实现基因组靶向编辑。锌指通过与靶分子DNA、RNA、DNA-RNA的序列特异性结合，以及与自身或其他锌指蛋白的结合，在转录和翻译水平上调控基因的表达。正是因为锌指蛋白的特异性，使得科学家可以人工构建锌指蛋白，而构建锌指蛋白的模块，就是人类基因组序列中筛选出的56个具有不同dna结合特异性的锌指，通过上调或下调启动子区域，使得锌指蛋白与转录激活或抑制域的融合分别产生有效的转录激活或抑制因子，也就是最常用的模块组装法。图2[7](a)锌指核酸酶(b)锌指核酸酶二聚体结合到目标位点的示意图。每个锌指区域用彩色球体表示，F1代表氨基端指，F2代表中指，F3代表羧基端指。FokIDNA的裂解区域以一个紫色的八边形表示，两个9-bp半位点之间的间隔序列可以是5或6个碱基对。FokⅠ限制性内切酶
FokⅠ是一种IIS型限制性内切酶,当其切割结构域形成二聚化则可发挥切割活性。但有时候会出现FokⅠ自身二聚化导致的非特异切割的问题,所以通常要将FokI内切酶进行突变,使FokI内切酶只有在异源二聚化时,才能发挥切割活性。因此,当两个单体分别与靶位点特异性结合且这两个靶位点之间的距离满足一定的要求时,两个FokI切割结构域才能形成二聚体,在两个靶位点中间的间隔区（Spacer）中进行切割,造成双链断裂。ZFNs技术的应用与“柏林男子”
锌指核酸酶用于操纵许多动植物的基因组，可通过介导基因破坏来用于人类难以攻克的疾病的治疗，最为典型的就是HIV和胶质母细胞瘤。对于HIV的治疗，相关研究指出，之前的治疗方法如联合抗逆转录病毒疗法极大地提高了HIV感染患者的生存率，并减少了病毒感染和癌症的发生率，但是这种方法会造成脂肪积累和脂肪萎缩从而影响患者的身体健康。后来，科学家发现，人类获得性免疫缺陷病毒类型-1(HIV-1)的感染需要一个CD4受体和一个趋化因子受体——主要是受体5(CCR5)，HIV-1进入宿主体内，首先与一个CD4受体结合，然后与CCR5相互作用来入侵宿主细胞，因此，假如能够将体内的CCR5基因进行改造或者有效地抑制该基因的表达，是不是就能够治疗HIV了呢？图3HIV与CD4、CCR5受体将CCR5与HIV联系起来的试验发生在一名“柏林男子”身上，此后他的故事也被相继报道，年，一名42岁的男性（TimothyBrown）HIV阳性病人在患HIV十年后，又患上了急性髓系白血病，作为急性白血病治疗的一部分，他不得不接受异基因造血干细胞移植。他的医生筛选了德国的骨髓捐赠者和数据库，与许多白血病患者难以找到合适配型的配对不同，蒂姆西则交了好运——数据库里有个符合的配型，这给了他的主治医生全新的操作空间。故事讲到这里，我们进行一个小科普：在人群中，有一部分人天生带有CCR5基因的突变(CCR5D32纯合子)，这让他们几乎对HIV免疫，让这些病毒无法入侵人体的CD4细胞，但这样的人群异常稀少，仅占北欧后裔的1%。幸运之神再一次眷顾了蒂姆西——这个配型中，第61号就带有这样的特殊突变。经过沟通，这名志愿者同意捐献他的干细胞。蒂姆西接受了移植的供体，术后，在医生的建议下，他停用了抗HIV感染的药物。3个月后，医生们没有在他的血液里找到HIV，这表明这次干细胞移植，成功压制了他体内的HIV身上没有发现艾滋病毒。尽管可能存在其他机制，但这一临床结果表明，供体CCR5阴性的造血干细胞以及从它们体内发育而来的抗HIVT细胞最终能够抑制或阻止HIV复制。图4“柏林男子”TimothyBrown随后，加利福尼亚州里士满与宾夕法尼亚大学的研究人员共同发起I期临床试验，他们试图通过设计特异性的ZFNs与DNA序列结合，产生双链DNA断裂通过机体自身的非同源末端连接途径修复，使得CCR5基因开放阅读框的永久破坏，从而阻断该基因在自体T细胞和造血干细胞中的表达，该试验的主要发起人是PabloTebas，结果显示，ZFNs敲除T细胞或HSCs（人体造血干细胞）中的CCR5基因，可有效抑制动物模型中HIV-1CCR5-tropic株的复制，临床试验中评估CCR5敲除T细胞的治疗益处。原则上，ZFNs介导的基因打靶可用于任何内源性基因的校正、突变、缺失或插入，前提是要设计出适当的锌指结构域。但是，尽管基于ZFNs的技术在生物研究和基因治疗方面具有潜在的重要用途，但该方法的进一步应用、发展和完善将需要一种快速简便的方法来设计锌指阵列，而设计困难、组装昂贵、耗时长、失败概率高等缺点限制了该技术的发展与应用，这也在一定程度上催生了新的组装起来更加简便成本相对较低的基因编辑技术。TALENs技术
继ZFNs之后一种较为灵活和高效的靶向编辑技术出现了—TALENs,TALENs又叫做转录激活样效应因子核酸酶,它的英文全称叫做Transcriptionactivator-likeeffect-ornucleases，TALEN嵌合核酸酶由两个部分组成，一是由TALE蛋白的DNA结合结构域，二是FokI内切酶的切割结构域，TALEN能够在特定位点进行切割从而使DNA双链断裂(Doublestrandbreaks-DSB)。TALE蛋白结构
TALE蛋白起初来源于哪呢？它其实是在一类植物病原菌——黄单胞菌属(Xanthomonas)中被发现并提取出的,由四个部分组成,分别是：N端分泌信号、中央的DNA结合域、核定位信号和c端的激活域。研究人员惊喜的发现,不同TALE蛋白中的DNA结合域有一个共同的特点,即由数目不同的(12～30)、高度保守的重复单元组成,每个重复单元含有33～35个氨基酸。这些重复单元的氨基酸组成相当保守,除了第l2和13位氨基酸可变外,其他氨基酸都是相同的。这两个可变氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基(RVD)。
图5TALEN单体构建不同的RVD能够相对特异地分别识别A、T、C、G这4种碱基中的一种:NN识别碱基G;NG识别碱基T;NI识别碱基A；HD识别碱基C。RVD的第1位氨基酸与蛋白质骨架结合,起到稳定RVD的作用；第2位氨基酸则直接与DNA的碱基特异识别,以上便是TALE识别DNA的机制。TALENs剪切作用
如果TALE要特异识别和结合某一特定DNA序列(靶位点),理论上我们可以按照该核酸的序列,将多个对应TALE重复单元进行串联,就可以“量身打造”出特异识别DNA序列的TALE蛋白,然后在TALE蛋白的C端融合一个非特异的核酸内切酶FokⅠ就构成了可以用于靶向基因组编辑的TALEN单体。剪切作用的发挥主要包含两步过程,第一步：两个TALE蛋白先对特定的基因组进行识别和结合。第二步,由FokⅠ核酸酶负责对DNA特定位点进行切割,从而造成DNA双链断裂,诱发细胞的DNA损伤修复机制,保护基因组稳定性,从而实现对基因组靶位点的编辑。近几年,TALEN技术已成功运用于体外培养人类细胞、水蚤、斑马鱼、鼠、牛等物种,并实现了基因组定点突变。TALENs自得到应用以来,无疑在基因编辑领域技术上获得突破性的进展。在基因精确修改方面,TALENs的应用使得人们有条件研究一些复杂的基因功能,而且TALEN介导的基因编辑要比用传统的基因打靶方案更加有效、快捷。CRISPR–Cas9
CRISPR/Cas9基因编辑技术是新一代基因组编辑技术，与前两个技术相比,它的设计简单，操作相对方便，并且具有效率高、成本低和多点编辑同时进行等优势。简单来说，CRISPR是一段间隔短回文重复序列,有一定规律性，Cas是与CRISPR相关的蛋白。CRISPR/Cas9系统利用一段具有特异性的RNA序列，引导Cas9蛋白特异地结合到靶序列处，然后对DNA进行切割，最后利用细胞的修复机制对切割后的DNA进行插入、缺失或替换等修饰，因此该技术也称为RNA指导的核酸内切酶(RNA-guidedendonuclease,RGEN)技术。因为CRISPR/Cas9具有多种优势，自从被发现后，它迅速吸引了社会各界的