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最近小编从锐博在线平台收到一些客户咨询riboEDITCRISPR-Cas9基因编辑体系及产品，也看到不少客户已在平台上订购了产品，效果反馈还是一如既往的高效。对大家普遍关心的CRISPR-Cas9基因编辑体系的疑问以及在使用过程中的注意事项，选择好一个适合的CRISPR体系和制定实验方案，实验也就成功了一半！这不小编再次梳理了有关CRISPR-Cas9常见问题解答和实验攻略，希望对小伙伴们有所帮助。1
riboEDITCRISPR-Cas9体系是什么？
riboEDITCRISPR-Cas9体系是锐博生物自主开发的采用天然复合物系统（crRNA和tracrRNA）的一种CRISPR基因编辑系统，提供基于Cas9mRNA的全RNA体系和基于Cas9蛋白的RNP体系，tracrRNA可实现大规模合成，靶向DNA目的序列的crRNA可以高通量合成，通过化学转染、显微注射或电转方式便可以便捷地进行基因编辑实验。
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riboEDITCRISPR-Cas9体系提供哪些产品？具有哪些优势？
该体系提供一系列方便高效的基因编辑产品，如果您希望筛选有效的gRNA，您可以选择订购编辑效率保证套装或标准套装，您还可以根据自己的实验情况选择：设计合成crRNA、通用型tracrRNA、Cas9mRNA、Cas9蛋白、mRNA转染试剂、mRNA转染对照（EGFP）、阳性对照crRNA套装、T7E1酶等产品。
采用riboEDITCRISPR-Cas9体系的优势有：
锐博已申请专利，采用优化的crRNA，tracrRNA和Cas9mRNA
瞬时表达，有效降低脱靶率
无DNA组分，不整合任何病毒或质粒基因
编辑效率更高，适用于哺乳动物细胞
毒性更低，激活先天免疫反应更小，减少细胞死亡
允许通过一次转染同时靶向多个基因进行编辑
无需繁琐的克隆构建过程，节约更多人力和时间
无需病毒级实验室，大大降低基因编辑对实验环境的要求
即用型体系，更加易用，更适合从小规模实验到大规模高通量筛选
兼容化学转染（mRNA转染/蛋白转染）、电转或电穿孔、显微注射
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riboEDITCRISPR-Cas9体系适用哪些实验？
riboEDITCRISPR-Cas9体系可用于编辑哺乳动物的肿瘤细胞、动物受精卵、干细胞（如动物胚胎干细胞、多功能干细胞或造血干细胞等）、T细胞、原代细胞、祖细胞等，如果您希望获得哺乳动物细胞的单/多基因敲除、细胞改造、构建稳转株、构建动物受精卵、胚胎干细胞或从受精卵开始大规模构建模式动物，那么riboEDITCRISPR-Cas9就非常适合了。4
riboEDITCRISPR-Cas9体系常见FAQ？
Q1：riboEDITCRIPSR-Cas9体系相比于质粒载体表达Cas9和Cas9稳定表达细胞株或慢病毒系统有什么优势？
1.riboEDITCRIPSR-Cas9的全RNA体系或Cas9蛋白体系相比质粒载体或Cas9稳定表达细胞株而言，Cas9蛋白为瞬时表达，脱靶效率低、无DNA整合风险和启动子兼容性问题，大大提高应用安全性。
2.即用型体系，通过一步转染，5-6个工作日即可完成编辑效率检测，操作简便，显著缩短实验周期。
3.不需要自行构建载体或包装慢病毒，不需要病毒级的实验室环境。
4.在大部分细胞中，比质粒表达载体具有更高的基因编辑效率。
Q2：使用riboEDITCas9mRNA进行细胞基因编辑，如何确定细胞的转染效率？
高转染效率是获得高效基因编辑效率的必要条件，可通过转染EGFPmRNA（货号：C-1）或其它荧光蛋白mRNA来确定细胞的转染效率。riboFECTmRNATransfectionReagent转染试剂可实现各种细胞类型，包括干细胞和原代细胞的高效率、低毒性转染，从而提高Cas9蛋白剪切和基因重组效率。对于转染试剂难以达到理想转染效果的细胞，推荐使用电转、显微注射等方式，具体实验条件需要自行优化。
Q3：riboEDITCas9mRNA以及crRNA、trarcRNA是否可以用于显微注射？
可以，riboEDITCas9mRNA浓度为0.5μg/μL，建议显微注射前调整浓度到20-ng/μL范围，并采用0.2μm针式过滤器确保去除所有可能堵塞显微注射针头的颗粒物或细菌。
Q4：如何快速确定crRNA的有效性？
crRNA/tracrRNA剪切效率与crRNA识别的靶序列有关，不同的crRNA剪切活性不同，推荐通过体外酶切实验，在体外酶切靶DNA片段，快速筛选有效的crRNA，获得高编辑效率的crRNA再进行后续的实验。
Q5：riboEDITCRISPR-Cas9基因编辑系统识别的PAM序列是什么？
riboEDITCas9mRNA和riboEDITCas9ProteinS.pyogenesCas9为S.pyogenesCas9，识别PAM序列NGG，N代表A，T，C，G。
Q6：riboEDITPre-designedcrRNA如何保证低的脱靶效率？
从crRNA的设计角度，使用更严格的序列比对分析，建议每个基因至少设计3-6条crRNA进行有效性筛选。
Q7：T7EI酶切检测编辑效率发现无剪切条带是什么原因？
可能原因如下：
1.细胞转染效率低，建议优化转染步骤或换用容易转染的细胞类型。
2.Cas9mRNA或Cas9蛋白降解，可通过设置阳性对照组（riboEDITPositiveControlcrRNA#1，货号crRPVS）共转染排除Cas9mRNA或Cas9蛋白降解的问题。
3.在细胞内，Cas9核酸酶无法接近靶位点或无法剪切靶位点，建议重新设计crRNA。
4.没有进行DNA片段的变性、退火步骤。可通过设置阳性对照组确认实验操作是否有误。
Q8：琼脂糖凝胶电泳分析剪切效率时非特异性条带多，无法分析剪切效率怎么办？
可通过设置阴性对照组来区分目标剪切条带和非目标条带。必要时，需重新设计引物，或通过优化PCR条件，来降低非特异性扩增。建议采用巢式PCR，提高扩增片段的特异性。
Q9：T7E1突变检测时，出现条带弥散的现象，应该如何解决？
由于T7E1本身具有弱的非特异切割DNA链的能力，所以遇到这种情况，可以增加DNA用量，降低酶的用量，减少酶切时间来降低非特异切割现象。
Q10：对于从事诸如干细胞、原代细胞或悬浮细胞，应该选择哪一种riboEDITCRIPSR-Cas9体系？
干细胞、原代细胞或悬浮细胞等难转染细胞，转染试剂一般很难达到理想的转染效果，电转方式更适合这类细胞的转染，根据目前文献支持，Cas9RNP体系用于电转具有更高的基因编辑效率，对于上述难转染的细胞推荐用riboEDITCRISPR/Cas9RNP体系，具体实验条件需要自行优化。
Q11：riboEDITCas9mRNA是否可以用于多个靶点或基因的编辑？
可以，通过混合多条crRNA与tracrRNA和riboEDTCas9mRNA共转染，可实现对多个靶点或基因的编辑，最佳共转染体系需自行优化，请保证crRNA和tracrRNA按1:1加入。
Q12：mRNA转染与DNA转染相比，有哪些优势？
1.DNA转染需要进入细胞核，对于快速分裂的细胞才能达到理想的转染效果，而mRNA转染只需进入细胞质，可大大提高有丝分裂后细胞或缓慢分裂细胞的转染效率。
2.没有转录过程，蛋白表达更快速，缩短实验周期。
3.更加安全，无DNA整合风险。
Q13：如何用riboFECTmRNATransfectionReagent转染Cas9mRNA和sgRNA进行基因编辑？
riboFECTmRNATransfectionReagent适用于转染mRNA、lncRNA、CRISPRsgRNA或crRNA/tracrRNA、siRNA、miRNA、小于1kb的双链DNA或HDR模板。尤其适用于Cas9mRNA和crRNA/tracrRNA共转染进行基因编辑，转染步骤请参照《riboEDITCRISPR-Cas9体系使用说明》实验方法部分riboEDITCRISPR/Cas9mRNA操作说明。当利用CRISPR进行基因敲入，需自行优化Cas9mRNA、crRNA/tracrRNA及HDR模板共转染体系，以获得最佳效果。
Q14：转染过程中，细胞培养基内能否含有血清及双抗？
riboFECTmRNATransfectionReagent是一款低毒、高效的转染试剂，血清的存在会影响转染复合物的形成，请确保在孵育转染复合物时使用的是无血清培养基。孵育结束后，转染复合物可直接加入含有或不含有血清/双抗的细胞培养基中，无需更换培养基，操作简便。
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