研究背景
一些研究表明，与VP16融合能够将一个转录抑制功能的转录调控因子转化为激活因子，与敲除系拟南芥植株相比，其表型类似或更强。评估VP16融合系和多基因敲除系的表型及其靶基因的表达，了解VP16融合系在植物中的功能转化是如何发生的具有重要意义。
Mediator25（Med25）已被确定为哺乳动物细胞中的特定VP16靶标，并且对VP16的反式激活活性至关重要。拟南芥Med25与许多转录因子相互作用，表明其在植物转录调控中的重要性。但是，尚不清楚植物Med25是否也与VP16相互作用以及VP16反式激活活性是否必需。
研究结果
作者首先将VP16融合FLC的转基因拟南芥植株（以下简称35S：FLC-VP16）与带有空载体的对照组植株和FLC过表达的转基因植株（35S：FLC）进行了比较。发现所有35S：FLC-VP16T1植株在长日照和短日照条件下均比对照组植株的平均值开花早，抽薹时叶片数分别为7.69和19.18(图1)。相反，在长日和短日条件下，在35S：FLCT1植物中均观察到了晚花表型。但35S：FLCT1植株的开花表型在各单株之间存在差异，表现出晚花，正常花和早花。
接下来作者分离了FLC高表达的纯合转基因系（图2A和B），并在长日照和短日照条件下将它们的开花时间与flc、svp单敲除系和flcsvp双敲除系的开花时间进行了比较（图2C和D）。发现在长日照和短日照条件下与对照组植株相比，35S：FLC和35S：FLC-VP16分别显示晚花和早花。如前所述，flc和svp的开花早于WT，flcsvp的开花更早。而35S：FLC-VP16的花期又早于单敲除和双敲除系。这些数据表明，VP16融合系统发挥了强大作用，并在具有冗余基因的多功能缺失系中产生了较强的表型。
Tips
SVP是FLC冗余的花抑制因子，flcsvp双功能丧失系在短日照条件下显示出更强的早花表型。
为了确定35S：FLC-VP16植株早花表型强的原因，作者分析了FLC和SVP，FT和SOC1的主要抑制靶标的表达水平（图3A和B）。在短日照条件下，野生型拟南芥中不会表达依赖光周期诱导的FT和SOC1，空载植株和35S:FLC中FT和SOC1转录水平较低，但在35S：FLC-VP16中观察到明显的上调（图3B）。并且35S：FLC-VP16中FT和SOC1的上调又强于flc，svp和flcsvp，这表明VP16融合至FLC对靶基因表达的影响更大。
为了测试这种上调是否由VP16融合导致的FLC转录抑制因子活性逆转引起，作者使用拟南芥叶肉细胞原生质体系统进行了一种瞬时检测(图3C)。与对照阴性效应质粒35S:GUS-VP16相比，使用35S:FLC作为效应子时，融合FT(FTpro:LUC)或SOC1启动子(SOC1pro:LUC)的荧光素酶(LUC)活性显著降低。相比之下，35S:FLC-VP16显著诱导FTpro:LUC和SOC1pro:LUC的活性。这些结果表明，FLC转录抑制因子的活性通过与VP16融合有效地转化为激活因子的活性。
为了测试植物Med25是否在体内与VP16相互作用，作者使用本氏烟草系统共表达标记的拟南芥蛋白进行了免疫沉淀测定（图4A）。将标记有FLAG的Med25（FLAG-Med25）与GFP-FLC，GFP-FLC-VP16，GFP-VP16或GFP共表达，并用α-GFP抗体免疫沉淀包含GFP标记蛋白的蛋白质复合物。FLAG-Med25与VP16融合蛋白GFP-FLC-VP16和GFP-VP16免疫共沉淀，但未与GFP和没有融合VP16的GFP-FLC免疫共沉淀，这表明VP16在体内与拟南芥Med25直接或间接相互作用。为了进一步研究VP16和Med25之间的关系，作者又在本氏烟草叶中进行了BiFC分析（图4B）。仅当VP16融合蛋白和Med25共表达时才检测到特异性荧光，这表明VP16和Med25在体内直接相互作用。
最后作者在WT和Med25单基因敲除系（pft1–2）中进行了瞬时测定，以确定Med25是否是VP16激活活性所必需的（图5）。WT和pft1-2暗示Med25不是拟南芥中VP16的独有共激活因子，并且存在转录激活的其他关键机制。
评述
由于基因功能冗余，拟南芥中大多数单个功能丧失的突变体均未显示任何可检测的表型，这使得基因功能分析变得困难，VP16融合技术的成功运用为我们提供了新的思路。
该研究并没有观察到Med25功能缺失对VP16反激活活性的显著影响，提示了其他未确定的关键机制，为研究尚未确定的植物转录调控分子机制提供了重要线索。进一步分析Med25、VP16及其相互作用物在植物中的功能，也对理解植物基因调控机制和开发控制基因表达的新技术具有重要意义。
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