量体温的日子即将过去，而量科研成果的日子才刚刚开始，话说科研中最关键的也是最有收获的一步即是科学的验证。告诉我您要发多高分的文章，我们将给您分享后续验证的各种方法，都是谁用都说好的款，总有一款适合您。还等什么？让我们紧跟小编的步伐进入学习的殿堂，您准备好了吗？
首先我们来看一下为什么要做验证实验呢？
转录组测序是以数学模拟计算表达量，筛选的基因比较多，一定程度上会有误差，而荧光定量与转录组表达是不同的方法，是对特异基因表达量的检测，特异性相对更高。
二代测序准确，体现在整体趋势准确，具体到每个基因，准确性还没有那么高，如果一个转录本有很多种剪切体，不同的定量引物做出来的结果都不同，也不能说荧光定量不准。同理，测序比对等环节也是有机会出现错误的，所以需要两种方法互相check一下，一个所谓数学方法，一个所谓实验方法，干湿结合，才能确保分析结果的可靠性。
接下来我们看一下干货区，重点展示验证实验几种方法以及实验原理、操作以及对应的成功案例。
表达水平验证：qRT-PCR目前公认的最常用也是最好用验证方法没有之一，堪称教科书式的分析流程，和转录组学研究已是标配。
一qRT-PCR实验原理：提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。
二qRT-PCR验证注意事项：（1）primer设计：根据研究的转录本序列，设计primer；
（2）建议在验证之前对primer的扩增效率进行评估（其实就是对模板梯度稀释），PCR效率在90%-%可以接受，另外模板的浓度也不要太高，Ct在15-35定量是比较准确的。
三qRT-PCR验证成功案例：中文题目：镉对二倍体小麦的毒性影响以及镉响应的分子机制
DOI：10./j.jhazmat..04.
期刊：JournalofHazardousMaterials
影响因子：7.65
发表时间：.04.15
1.研究背景及意义：
研究背景：镉（Cd）是一种广泛的土壤污染物，容易在小麦中累积，对人体健康构成潜在威胁。我们的目的是研究镉对小麦的毒害作用及其分子机制，其主要研究意义在于：
（1）有助于了解小麦镉的毒性及镉反应的分子机制。
（2）有助于通过育种鉴定降低镉污染的靶基因。
（3）有助于促进镉污染地区的植物生长和维持食品安全。
2.技术路线：
3.验证结果展示：
通过qRT-PCR验证基因，由转录组数据确定的表达水平与qPCR分析中获得的表达水平一致，进一步证实了RNA测序和RT-qPCR之间产生的RNA测序数据的可靠性。
4.研究结论：
此项研究中，对Cd处理（10μmCdSO4）2和5天后二倍体小麦（Triticumurartu）幼苗的生理指标，形态和基因表达模式进行了评估。镉处理导致芽和根中脯氨酸和谷胱甘肽的含量增加，叶尖轻微受损，根尖严重受损，根分泌增加。转录组分析表明，镉胁迫5d后，芽和根中的差异表达基因（DEG）明显多于镉胁迫2d后，并且芽的DEG与根差异更大。GO与KEGG富集分析结果表明，在Cd处理下富集的途径是“DNA复制”和“苯丙烷类生物合成”。这些发现为小麦对Cd胁迫的响应机制提供了信息，并为降低Cd毒性和保护食品安全提供了理论基础。
功能水平验证：包括功能获得和功能缺失，它是高分文章的必备“利器”。一功能获得和功能缺失的原理1.功能获得——过表达基因
其原理是：构建克隆，将目的基因连接在特定的载体（可以是慢病毒载体、腺病毒载体、质粒）上，在载体上一般含有增强基因转录的promoter，将克隆导入表达细胞/愈伤组织中，即转化或转染，转染进入细胞内的外源基因在其上游强启动子的作用下可以直接过量表达。
2.功能缺失——包含敲除、敲减以及沉默基因表达
常用方法：RNA干扰、CRISPR/Cas9、T-DNA插入、位点反转和启动子缺失等；
RNAi的原理是将与目标基因mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA，与内源性mRNA编码区同源的双链RNA)导入细胞，使目标mRNA发生特异性降解，导致其相应的基因沉默——转录后水平基因调控沉默机制(PTGS)。
二功能验证成功案例：中文题目：转录组与代谢组联合分析揭示了IiPLR1在板蓝根中松脂醇的积累起关键作用
期刊名:JournalofExperimentalBotany
DOI:10./jxb/erv
IF：5.36
发表时间：.07.10
1.研究背景：
松脂醇是一种木质素，具有抗菌、抗感染、抗氧化等生化活性，然而松脂醇在植物体内的含量积累非常低。使用代谢工程可以增加植物体内有益健康的化合物的含量。植物代谢过程非常复杂，而且多个不同的水平，使代谢的结果往往难以预料，而多拷贝的基因家族在代谢途径中有不同的作用。
2.实验设计：
（1）材料：经茉莉酸（MeJA,0.5μM）处理的板蓝根须根
（2）时间点：0（对照）/1/3/6/12/24h
（3）测序平台：IlluminaHiseq,PE
3.技术路线：
4.验证结果展示：
（1）结果发现，IiPLR1与药用成分最相关的松脂醇密切相关（r=0.98），而IiPLR2、IiPLR3和所测量的木质素都没有显著相关性。对r0.6基因做基因代谢网络图，可发现有27个基因与所测的5种木质素有关，其中有7个基因与松脂醇呈正相关。
（2）RNAi使得IiPLR1/2/3的表达显著降低，其他两个IiPLR成员有轻微变化（图A,B）；
IiPLR-RNAi株系与对照相比，松脂醇含量显著降低，这与IiPLR1mRNA水平密切相关（图C）；
盐酸间苯三酚显色法发现，IiPLR1-RNAi株系呈现较弱的褐化，表明在其体内木质素、酚类物质含量较低（图D）。
（3）IiPLR1在不同组织（A）中和在MeJA（B），ABA（C）和UV（D）不同处理下不同时间的表达情况（对IiPLR1的功能的鉴定）；
（4）过表达的IiPLR1在板蓝根须根中对木质素松脂醇的影响；
（A）IiPLR1过表达载体的示意图；（B）IiPLR1转录本的表达丰度；（C）IiPLR1转录本的表达，以及（F）转基因毛状根系中的lariciresinol含量；（D）毛状根系中ovx-2，ovx-8，ovx-9，WT和CK的生长时间曲线；（E）间苯三酚-HCl染色之前（上部）和之后（下部）CK对照（左）和IiPLR1-OVX毛状根（右）的表型对比结果。
5.研究结论：
本研究中，通过使用在不同时间点用茉莉酸（MeJA,0.5μM）处理的板蓝根须根，分析了RNA测序（RNA-Seq）表达谱与木脂素含量之间的相关性，揭示了靛蓝毛状油酸/松脂醇还原酶1（IiPLR1），而不是IiPLR2或IiPLR3，对松脂醇的积累起了很大的作用。RNA干扰（RNAi）导致的基因沉默表明IiPLR1确实影响了松脂醇的生物合成，而对IiPLR2或IiPLR3的抑制并没有显著改变松脂醇的表达量。重组IiPLR1可有效降低松脂醇含量。此外，IiPLR1的过表达验证显著增强了靛蓝毛状根中松脂醇的积累，最佳品系产生的松脂醇，比野生型高约6.3倍。这项研究揭示了如何通过更准确或更合适的基因工程策略有效地增加所需的代谢产物，并通过使用毛状根培养系统作为生物反应器，为大规模商业生产药学上有价值的松脂醇提供了有效的方法。
RNA-蛋白互作验证RNA结合蛋白（RNABindingProtein）是一类伴随RNA的调控代谢过程，与RNA结合的蛋白质的总称。RBP伴随RNA生命始终，其主要作用是介导RNA的成熟、转运、定位和翻译；一个RBP可能存在多种靶标RNA；且其表达缺陷会造成多种疾病。
1.RNA-pulldown—已知RNA，寻找结合蛋白
原理：将目标RNA进行标记（如生物素探针标记）再与蛋白共同孵育，从而形成RNA-蛋白质复合物，通过SDS-PAGE分离蛋白质，最后通过WB(westernblot)或质谱（massSpectrometry）检测蛋白质。
2.RIP—已知蛋白，寻找RNA
原理：用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经分离纯化对RNA进行分析。
3.EMSA—已知RNA,已知蛋白，判断是否结合
原理：通过凝胶电泳迁移检测蛋白-RNA互作，将设计好的带有标记的RNA探针与样本蛋白混合孵育，形成蛋白-RNA复合物。因复合物分子量大，会在聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快。利用非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，来确定RNA结合蛋白的特异性。
定位研究验证亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位，例如在核内、胞质内或者细胞膜上存在。越来越多的证据显示，在生物学过程中位于不同的亚细胞器RNA拥有不同的功能，亚细胞定位有利于更深入地了解RNA的生物功能
1.FISH（免疫荧光原位杂交）：其原理是：将已标记的RNA探针（可在探针上标记荧光基团、生物素、地高辛等）与组织切片或细胞中的待测RNA中的互补序列杂交,从而对组织细胞中的RNA进行定性、定位和相对定量分析。
2.数据库查找：
（1）RNALocate数据库（
