基因工程小鼠模型是研究基因功能、深入了解疾病病因并确定药物反应最主要的动物模型。CRISPR-Cas9系统是对靶向基因进行特定修饰的最新一代基因编辑技术。这项技术也是目前用于基因工程小鼠模型构建的前沿方法。简单来说，CRISPR-Cas9系统是将Cas9蛋白和靶向RNA注入小鼠受精卵，就能实现基因敲除，同时注入带有同源序列的供体DNA则可实现基因敲入，显著减少了基因工程小鼠模型的开发时间，从而提高了构建效率。但是，纯合突变一方面经常会导致胚胎致死或发育缺陷，另一方面此类突变没有组织特异性，从而限制了其在研究成年组织中基因功能的使用。
除此之外，尽管CRISPR-Cas9系统介导的突变能够在受精卵中快速产生复合突变体，但是遗传镶嵌和等位基因分离却限制了其产生大量没有进一步交叉实验小鼠的能力。
年4月纪念斯隆-凯特琳癌症中心ScottWLowe教授及其科研团队在NatureBiotechnology上发表名为InducibleinvivogenomeeditingwithCRISPR/Cas9研究论文。这篇文章主要工作是开发了诱导型CRISPR(iCRISPR)技术，此技术不但能够在多种组织中进行基因修饰以及调控目的基因修饰的频率和片段大小，还能够诱导多个目的基因的双等位基因突变。
结肠腺瘤性息肉病基因(APC)是一种肿瘤抑制基因。大多数APC基因突变的结果是在其下游形成提前的终止密码子,导致APC蛋白功能的障碍.该基因容易发生自发的胚系突变。研究人员将针对鼠源APC和Trp53（这个基因的失活常常与APC结肠癌同时发生）的靶向RNA和诱导型Cas9序列构建到同一质粒上(Figure1A)，将此质粒转染到鼠胚胎干细胞中后，对照蛋白GFP表达和目的基因修饰在强力霉素诱导处理2天后可以观察到，并且这个诱导作用具有时效性，诱导时间越长效果越明显。另外发现胚胎干细胞中两种靶向RNA作用下引起的突变效率几乎一样，表明两种靶向RNA同时构建在同一表达质粒上并不会影响Cas9的编辑效率(Figure1B-D)。此外进一步验证此项技术诱导多个目的基因的双等位基因修饰的能力，结果表明在大约94%的胚胎干细胞特定基因座上出现双等位基因突变的现象。以上结果表明iCRISPR技术可以实现使用单一转染质粒诱导多个目的基因突变。
Figure1InduciblegenomeeditinginmESCs.
在一些胚胎干细胞克隆中，研究人员发现在没有强力霉素诱导表达情况下也会出现基因敲除的现象（称为off-doxmutagenesis），大概有33%胚胎干细胞克隆出现了此类突变。这可能是在转染过程中由于Cas9表达泄露引起的。另一方面CRISPR/Cas9系统的基因编辑本身会引起脱靶突变。此项工作中研究人员通过使用变异切割酶Cas9n以及优化的靶向RNA来降低脱靶突变，从而提高了对目的基因座修饰的特异性。
在离体细胞中检测iCRISPR技术的可行性，研究人员进一步构建了R26-rtTA/c3GIC9-Apc小鼠（条件性敲除Apc）和R26-rtTA/c3GIC9-Apc/Trp53（条件性Apc/Trp53双敲除小鼠）,在给与10天的强力霉素后通过免疫荧光实验观察到Apc和p53蛋白水平显著降低，同时对肠绒毛的突变分析也证实了其基因变化。总体来说，条件性敲除Apc小鼠表现出肠腺细胞增殖加快、分化降低、潘氏细胞异位增多的现象（Figure2）。为了进一步评估iCRISPR技术的诱导时效性，利用Apc失活会诱导体外培养肠类器官的形态发生可测量的变化来设计实验。R26-rtTA/c3GIC9-Apc/Trp53双敲除小鼠分别连续给与2天、4天、7天的强力霉素后离体培养肠类器官10天，结果发现2天、4天、7天的强力霉素处理后肠类器官变成球状的比例分别是20%,40%,%。同时发现Apc和p53的蛋白水平几乎全部缺失。以上结果表明iCRISPR技术具有诱导时效性并且能有效编辑多个基因的修饰。
Figure2Induciblegenomeeditinginadultmice.
为了综合评估Cas9/Cas9n诱导后产生的插入或缺失的频率，研究人员对强力霉素处理后小鼠的肠和胸腺基因组中的目的基因座进行了测序。尽管不同位点和组织中插入或缺失序列的大小和类型差异很大，但两种组织通过强力霉素诱导10天后都显示了高频率（50-85％）的靶基因修饰。理论上Cas9引起的移码（frameshift）突变和整码（in-frame）突变的比例为2：1，意外地是Apc的单独突变为97%的移码突变，而p53单独突变为70%的移码突变，p53和Apc同时突变的移码突变和整码突变的比例为2：1。虽然Apc的突变有移码突变的选择倾向性，但是p53的突变没有观察到此类偏向性。而两个基因座同时突变的结果显示CRISPR调控的修饰是均衡的，说明这个系统是可以用于研究基因突变的真实效果。
iCRISPR技术诱导的基因突变是否具有组织特异性呢？诱导特定空间位置的突变是由rtTA等位基因及其Cas9的表达位置决定的。研究人员利用高压水枪法将带有rtTA质粒导入小鼠肝脏，组织分析显示，全部和非磷酸化的β-catenin蛋白如预期的特异地在肝细胞的胞浆和核中积累。因此，以压力递送或者或Cre依赖性系统方式来控制rtTA的表达，iCRISPR系统可适用于产生组织特异的体内诱导型基因缺失。综上所述，我们的数据表明，体内依赖于强力霉素刺激的Cas9或Cas9n的表达所诱导靶基因修饰能够达到传统的基因敲除类似效果。
最近研究报道了使用病毒传递或DNA转染应用的CRISPR/Cas9介导的体内基因编辑。虽然基于CRISPR的快速编辑基因可以产生基因修饰和染色体重排，但是此类方法仅限于肝，肺，脑等特定组织。从小鼠模型的角度出来，尽管iCRISPR技术类似于基于Cre的可诱导系统（即CreER），但它们的有效性很难直接进行比较。与基于LoxP的等位基因缺失不同，CRISPR/Cas9依赖于非同源末端连接的不精确的DNA修复引起的，从而产生大量非均一的突变体。此外，Cre介导的敲除效率在基因组区域和重组片段大小两方面是变化的，而sgRNA序列或非同源末端连接效率的变化可能会影响CRISPR/Cas9的编辑修饰。重要的是，研究人员并不认为iCRISPR技术能够替代基于Cre/LoxP的条件敲除，而是提供了一个研究体内基因功能的互补可行的方法。
总的来说，这种新型诱导型CRISPR技术，给基因编辑装上了一个“时间开关”，实现在特定时间窗内进行基因敲入或敲除。
本文转自：abcam
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