关于解析宿主关键基因与肠道菌群互作调节表型变化机制的研究模式的探讨与思考
供稿人：程伟整理编辑：谢许茵
众所周知，表型是由基因与环境共同决定的。基因表达影响宿主表型的规律随着基因组学研究的广泛深入，不断被我们熟知和更新。肠道菌群，作为内化的环境因素，能释放多种代谢产物进入体液循环，调控远端不同组织器官的代谢，因而被证实存在“肠-脑”、“肠-肝”、“肠-肺”与“肠-肌”轴等多种轴向远程遥感调控通路。经由这些通路，肠道菌群几乎影响着全身所有生理或病理代谢过程，其靶向作用关系复杂。
目前，尽管在这两个方面都有许多研究进展，然而，主流的研究一直是将肠道菌群与宿主基因分开探索各自影响表型变化的可能调控网络或代谢机制，只有少数的研究者涉及二者间互作调控表型的分子机制。事实上，科学家已经针对人和小鼠进行了不同规模的全基因组关联性分析，发现多个与小鼠或人的肠道菌群相关的基因座，如饮食相关的宿主基因座能影响肠道菌群组成，Wang等研究发现VDR的遗传变异与肠道菌群β多样性有关；另外，Bonder等研究发现一些基因座不仅与菌群组成相关，还与菌群的代谢途径及其基因本体（geneontology）有关联。相关研究发现，肠道双歧杆菌是可遗传的，而且双歧杆菌的丰度与宿主的乳糖酶基因LCT存在显著相关，同时发现乳糖不耐受者的肠道双歧杆菌含量较高，双歧杆菌能够分解乳糖从而弥补了人体基因的缺陷；肠道菌群和宿主之间的这种相互作用也存在于免疫系统中，肠道菌群影响免疫系统的建立、发育和功能，而宿主免疫系统却塑造了肠道菌群的组成和多样性等。除了这些关联性分析发现外，也有少数研究证实了它们的关联性以及二者互作影响表型的调控网络，例如：脆弱拟杆菌通过刺激lncRNABFAL1过表达来促进CRC肿瘤的生长；R.intestinalis鞭毛蛋白通过激活p38-Stat1途径来促进肠上皮lncRNAHIF1A-AS2的转录表达，继而使NF-kB/Jnk通路失活，抑制结肠炎症反应。此外，也有研究发现，某些基因水平的变化不会对肠道菌群的组成与结构产生显著影响，如：在同一性别内转入基因lncRNA-GTL2后，小鼠肠道菌群的结构和组成总体上没有显著差异。
由此可见，宿主基因与肠道菌群之间确实存在相互作用，也正是这种互作共同决定了表型的发生与发展。但是，对类似于由微效多基因与肠道菌群共同决定的表型而言，宿主体内确实可能存在与肠道菌群并不显著关联的基因，毕竟这种基因的功能单一且效应微弱；相反地，我们推测与肠道菌群显著关联的宿主基因往往处于调控表型变化的重要节点。总言之，基于宿主关键基因与肠道菌群互作来解析特定表型的潜在机制更加科学合理，而且这种解析方式不仅能提供理论研究的参考价值，更适合为开发个性化精准营养食疗与个性化疾病防治药物等提供实际参考。
正是由于这种表型解析策略的科学合理性以及潜在的巨大应用价值，我们将整合三大应用模型（基因工程鼠、无菌小鼠、重度联合免疫缺陷鼠）与三大关键技术（基因编辑、无菌动物制备、粪菌移植）以及不同处理方式（灌胃不同粪便或肠内容物、饲喂肠道菌群的代谢产物、抗生素处理等），结合表型测定与转录组、蛋白组、代谢组、宏基因组以及培养组等多组学检测方法，期望筛选验证后获得功能性菌群或菌株及其效应性代谢产物，以及与之关联的基因表达调控通路或代谢通路。这是我们提出的一种应用于解析宿主关键基因与肠道菌群互作调控表型机制的研究模式（见下表），下面我们将针对相关性、因果关系与“肠道菌群—宿主基因—表型”的调控通路模式进行探讨与思考。
01
相关性的建立
对于表型显著差异的个体，采集适量的样品（组织样与粪样）进行测序检测与分析，如果能分别筛选发现显著差异的基因与肠道菌群，则说明它们同表型之间可能存在相关性，同时还可以将显著差异的基因与肠道菌群进行关联分析；此外，如果表型能够量化，可以直接进行关联性分析，从而初步判断宿主基因-肠道菌群-表型三者之间的相关关系，甚至获得候选基因与候选菌群or菌株等（视测序情况而定）。该方法是“由果溯因”，关联性结果是基于统计学分析，需要足量的表型差异化个体，虽准确性较高，但仍需要后续实验验证。
如果前期研究已经获得调控人或猪表型显著变化的关键基因，成功构建基因工程小鼠模型并获得与之对应的差异表型，甚至已经找到靶标调控通路，这足以说明它同表型的显著关联。接下来想探究关键基因与相应表型是否分别与肠道菌群相关联，从而为开辟新领域的研究，便于研究成果转化奠定基础。此时，我们可利用16SrDNA测序技术初步对比研究基因工程小鼠与野生型小鼠的粪样菌群组成与结构，检测是否存在显著差异，如果表型可量化，可进一步作关联性分析。此外，为探究肠道菌群是否与表型显著相关，目前主流方法是将显著差异表型的人或猪的粪样移植到无菌小鼠，通过表型恢复情况及其是否仍存在显著差异来初步判断肠道菌群整体与宿主表型的相关性；如果对猪进行研究，也可以利用外物干扰肠道菌群组成与结构等的方式来探究其相关性，例如：抗生素饮水或益生元/益生菌的补充等。
相关性的建立是研究宿主关键基因与肠道菌群互作调节表型变化规律的前提，目前主要依赖于“由果溯因”的统计分析与“由因得果”（表型恢复实验）的实验验证两种方法，虽然我们不能妄下结论，认为显著关联就一定具备值得深挖的价值，但它的确指明了一个供我们努力寻找宝藏的方向。
02
因果关系论证
较正常健康自然状态而言，疾病表型的出现与畜牧经济性状的人为选择性改良等都是量变引起质变的结果，其过程非常复杂，量变的因素包含物理、化学与生物等不同来源。宿主基因与肠道菌群正是累积量变的“接收器”，一旦它们发生较大改变就会导致表型的变化，由此可见，它们与表型变化之间是一种因果关系。然而，这种因果关系往往并不是简单单向的直线关系，而是一种复杂的循环关系，类似于“鸡蛋相生”的现象，例如：转移性肿瘤细胞可作为“果”的种子接种至健康小鼠后会诱发小鼠基因与肠道菌群出现“因”的变化，虽然这种变化可能并非与最初的“因”相一致。此外，肠道菌群与宿主关键基因不一定同时都是表型的诱因，有可能只有一方主导，另一方被迫服从，例如：关键基因的突变很可能直接诱发疾病表型的产生，而肠道菌群可能先经历短暂的代偿抵抗阶段，然后终因能力有限而反受影响，成为疾病表型的“助手”，毕竟肠道菌群也能受到宿主代谢调节。此外，Pettersson等发现从老年小鼠中收集的微生物能促进年轻小鼠神经发生的能力。BrianKennedy对此发表观点，认为老年小鼠中的微生物组可以促进年轻受体的年轻表型，是因为为了弥补老年鼠机体积累的缺陷，肠道菌群发生了正向变化，更能刺激机体保持健康。总言之，肠道菌群—宿主关键基因—表型之间的因果关系是复杂多变的，不同个体之间可能存在不同的模式，这更加体现了发展个性化精准营养与疾病医疗的重要性。
正是基于这种复杂的循环因果关系，我们可以有机整合正反两个方向的研究模式——由因得果的研究模式，即在动物模型上，通过干预关键基因表达（CRISPR/Cas9等）与干预肠道菌群的组成与结构（动物模型无菌化制备、抗生素处理与FMT等）来造“果”，与由果溯因的研究模式，即直接对人或猪显著差异表型的相应样品进行多组学检测与统计学分析来溯“因”，充分解析宿主关键基因与肠道菌群互作调节表型变化的分子机制（下表实验方案仅供参考）。
03
调控网络的复杂性
一种表型变化背后潜在的机制往往是非常复杂的，可能涉及许多不同基因不同肠道菌群的互作通路，对于数量性状而言，不同互作通路的“贡献值”可能大小不一，故而研究关键（主效）基因与功能性肠菌互作通路对表型的调控机制就非常有意义。每一个互作通路都可以简单地看作是一个由“顺序（上下游关系）-选择（正向or负向调节）-循环（反馈回路机制）”构成的组织模块。基于建立相关性与理解因果关系的基础上，我们可借鉴目前已有的相关研究报道来大概了解与功能基因组学研究相似但又不完全相同的研究模式。
多项研究证明NOD2、FUT2、ATG16L1基因是炎症性肠病（Inflammatoryboweldisease,IBD）的风险变异位点，这些基因的变异与肠道菌群的组成结构改变显著相关，易感性基因NOD2与ATG16L1发生异常突变，使树突状细胞发生非经典自噬，因而无法感知Bacteroidesfragilis（脆弱拟杆菌）通过代谢产物发出的保护性信号，最终无法诱导调节性T细胞（Tregs）抑制粘膜炎症而导致IBD发生(Chuetal.,；Halletal.,)；反过来，IBD的发生必然会导致肠道菌群的失衡或紊乱。这充分体现了关键基因在调控下游代谢通路的改变、表型的变化以及肠道菌群稳态的过程中起到了关键的作用，揭示了肠道菌群（Bacteroidesfragilis）与宿主基因（NOD2与ATG16L1）互作诱发IBD的调控机制。
图片来源于网络
前面提到的，脆弱拟杆菌刺激lncRNABFAL1过表达，从而与miR--5p和miR-a-3p竞争性结合，导致RHEB/mTOR途径激活，最终促进CRC肿瘤的生长（Baoetal，）；肿瘤的生长与发展必然会导致机体代谢紊乱，从而影响肠道菌群的代谢与稳态。该研究虽然只是用实验验证了产肠毒素的脆弱拟杆菌（ETBF）与lncRNABFAL1的上下游调控关系，并未解析ETBF如何促进lncRNABFAL1的表达，但也不妨为我们深入研究肠道菌群与宿主基因互作调控肿瘤发生发展提供一种全新的研究思路和研究模式。
此外，Wang等（）发现，脂蛋白酸（LTA），作为副干酪乳杆菌（D3-5）的细胞壁成分，通过调节TLR-2/p38-MAPK/NF-kB途径增强粘蛋白（Muc2）的表达，从而减少与年龄有关的肠道渗漏和炎症，并改善机体和认知功能。类似这样的研究还有很多，如来自俄勒冈大学研究团队发现β细胞的生长分裂可能是由肠道微生物分泌的某种关键蛋白控制的，LPS诱发机体炎症的研究等。图片来源于相应文献在宿主与肠道菌群相互作用过程中，菌群可以通过代谢物等影响宿主，宿主也可通过饮食、药物、基因表达等影响菌群的结构和功能。宿主基因CARD9能影响肠道菌群的组成和功能，通过改变肠道菌群对色氨酸的代谢能力来影响结肠炎的发生；啮齿类和人粪便中主要由小肠上皮细胞和Hopx+细胞分泌的microRNAs通过进入细菌并调控细菌基因表达，从而影响其生长，维持肠道菌群正常稳态。Teng等（）研究发现植物来源的类外泌体纳米颗粒(ELN)被肠道微生物群吸收，并包含改变肠道菌群组成和宿主生理的RNA，ELNRNA可调节肠道菌群组成、定位和宿主生理，显著增强肠道屏障功能，减轻结肠炎。
图片来源于相应文献
对比以上所有研究，我们不难发现“肠道菌群—宿主基因—表型”三者之间存在“1因2果”与“2因1果”的因果关系，但因果之间的调控模式却是复杂多变的，仅根据以往的经验去理解和研究一般会走入误区，一个结论的得出必然需要强而有力的数据支撑，这是自然科学研究的根本——“用数据来解读事实”。
04
我的思考
4.1肠道菌群与其他器官的互作
肠道菌群作为一个整体，其复杂程度不亚于宿主机体本身，常被视为一个向体液循环传递营养元素与代谢活性调节因子等多种信号分子的“隐形”器官，但凡机体与外界环境（空气、饮水、食物等）直接接触的界面都会有它们隐藏的身影，因此它们必然与其它组织器官存在直接或间接的相互作用。
绝大多数肠道菌群对机体内组织器官的调控作用依赖于它们的代谢产物，主要包括维生素类、短酸类、多胺类、胆汁酸类、甲胺类与多酚类等。目前，至少有两篇研究报道表明，灭活的细菌与正常细菌相比具有相同，甚至更好的移植效果，这恰好证实了上述观点。此外，有临床证实，使用标准剂量的纯化微生物成分，更具备有益的效果，它们能克服微生物是否在受者体内存活并达到一定丰度和具备特定功能的不确定性，并可能比益生菌本身具有更大的潜力，因为菌株在不同微环境中的功能和生存能力具有差异，而且一个特定的细菌可能根据其寄住环境不同与宿主相互作用的方式也会有显著差异。
机体中大多数器官都具有分泌特性，所产生的效应因子进入血液或淋巴液后循环至其它组织，包括皮肤、肠道上皮等与微生物接触的界面，因此这类组织器官也可能具备独自反馈调节肠道菌群组成与结构的能力，其中最典型的器官包括大脑、肝脏、肺脏与骨骼肌等。正是这种反馈机制的存在，才使得菌群的稳态及其调节作用不至于失控而导致各种疾病，然而这种调节作用是以何种媒介物作为功效因子发挥调控功能的，不同组织器官的反馈调节是否具有特异性等都是值得研究的问题。
从本质上来说，肠道菌群与这些组织器官在代谢层面的互作其实就是“肠道菌群与宿主基因（特定组织器官中特定类型细胞的某些基因）互作调节表型变化”的执行与体现。
4.2如何研究肠道菌群及其代谢产物的功能
和宿主基因组一样，肠道菌群也是一个巨系统，而且更为复杂。如何解读其组成、结构与功能等信息已成为研究的热点。到目前为止，我们能从肠道菌群整体中分离部分单菌，再移植到无菌动物肠道进行功能验证，然而通过这种方法获得的细菌功能在一定程度上是有偏差的，毕竟肠道菌群是一个由许多不同细菌构成且与宿主肠道存在动态相互作用的有机整体，而且其不同组分间存在着复杂的共生、竞争等关系，因此这种模式很可能无法真正还原它在宿主体内的结构特征与功能效应等。借鉴基因组学研究单基因功能的范式，Guo等（）开发了一种基于CRISPR-Cas9技术敲除肠道菌群特定基因的方法，便于构建无需进行标记的不产生特定代谢物的细菌突变体，从而有利于探究它们调节宿主生物学和疾病过程的机制。
然而，该方法只是对细菌基因进行敲除等修饰，仍无法在原位对特定细菌进行敲除，因此只是研究了特定细菌的部分功能，尤其是部分代谢产物发挥的功效，而不是细菌自身的整体功能，毕竟细菌的基因表达很可能也具有时空特异性，在特定微环境中原本不会产生的代谢产物，受人为敲除的干扰，可能诱发其它代谢的变化等，这样就显得多此一举，甚至适得其反（个人愚见，仅供参考讨论）。由此可见，对肠道中定植原位的特定菌株进行敲除更符合其实际功能的研究，截至目前，仍没有这样的技术方法。但我坚信，随着科学技术的飞速发展，这种方法一定会出现，并将真正开启微生物组学功能研究的新纪元。
4.3关于肠道菌群与宿主基因互作模式的思考
肠道菌群功能发挥主要依赖于其代谢产物，由于产物成分的复杂，以及进入体循环前后发生代谢变化，所以较难研究它们是如何参与基因表达调控的。再加之，一个表型的产生，尤其是疾病表型的形成往往不是一种单菌株就能决定的，因为肠道菌群之间也存在复杂的相互作用。因此，目前很多研究发现只是停留在肠道菌群与宿主基因的相关性与共同影响表型变化通路的“上下游”关系（见下表）等基础上，至于二者究竟如何相互作用，仍有待深入研究。
虽然我们目前尚不清楚二者间的互作机制，但总体来说，我们不难发现，大多数表型变化最初的诱因往往是二者之一（主因），主因很可能通过代谢循环来引起次因的变化，最终导致表型的改变；当然，次因也有可能在表形变化前后“一变再变”。总言之，通过宿主基因与肠道菌群互作来解析表型变化的分子机制是复杂的，目前尚无固定的模式，可供借鉴的研究也很少，尤其是关于二者间到底如何互作的范例就更少了。因此，个人认为将特定细菌功能及其基因功能与宿主基因功能有机统一起来解析表型的潜在机制会成为下一个研究热点。
参考文献
1.LeamyLJ,KellySA,NietfeldtJ,etal.Hostgeneticsanddiet,butnotimmunoglobulinAexpression,convergetoshape
