临床预测模型构建培训
临床预测模型构建与统计分析进阶研讨会（12月19-20日）
年12月19-20
非动脉粥样硬化型及非炎症型动脉发育不良疾病（DAAD）可导致血管阻塞、动脉瘤、夹层及中动脉扭曲。多发性纤维肌发育不良（mFMD）便是其中一类，其组织学表现为中层纤维素蓄积，血管造影可见多处血管狭窄灶之间管壁扩张。而DAAD更严重时，可表现为动脉夹层及动脉瘤。虽然既往研究已经证明COL5A1基因的罕见突变与先天性结缔组织发育不全综合征显著相关，但COL5A1相关的频发突变是否与系统性血管疾病相关尚不清楚。既往研究也并未明确mFMD相关的单基因突变。
对此，来自密歇根大学的SanthiK.Ganesh教授团队着眼于四个独立家系先证者共同携带的COL5A1c.GA,p（GlySer）突变，通过临床信息，组织学验证，连锁不平衡分析，单倍型推断及mFMD队列人群的全外显子测序证明该突变与DAAD患者动脉夹层及肌纤维发育不良相关，该研究结果发表于心血管领域高水平期刊《Arteriosclerosis,Thrombosis,andVascularBiology》中，题目为“ANovelRecurrentCOL5A1GeneticVariantIsAssociatedWithaDysplasia-AssociatedArterialDiseaseExhibitingDissectionsandFibromuscularDysplasia”
结果解读
独立家系先证者的COL5A1c.GA,p（GlySer）突变
研究者检测到来自四个不同家系的DAAD先证者均存在COL5A1c.GA,p.(GlySer)突变。Sanger测序结果同样证明四名先证者均存在cGA杂合突变。四名先证者的临床表现各异，其中包含继发于颈动脉mFMD的卒中，回肠动脉夹层和动脉瘤破裂，冠脉夹层导致的心肌梗死及难治性高血压伴肺动脉瘤。
表1：先证者的临床信息及分子表型
COL5A1p.(GlySer)突变频率及解读
COL5A1c.GA,p（GlySer）频发突变未被记录在gnomAD和LOVDCOL5A1数据库中。而美国NHLBI数据库中记录了两名携带该突变的个体。本研究中一名先证者数据也被纳入ClinVar数据库中。由于该突变导致了胶原蛋白三螺旋中断域第一个三螺旋重复的倒数第二个甘氨酸变为丝氨酸，而既往研究表明胶原相关基因突变导致甘氨酸被其他氨基酸替代常常致病，因此推测该突变可能为致病突变。计算机算法推测也表明该突变可能导致蛋白结构和功能不良改变。根据年ACGS标准，该位点突变同样也定义为近似病理性突变。预测该基因导致功能缺失概率也与其不良效应相符。
表：COL5A1SNP的不良效应推断
携带突变的起始单倍型推断
与基因组数据库进行家系比对，主成分分析结果显示，这四名先证者属于中欧血统。分析25个SNP基因型连锁不平衡后，研究者发现4名先证者共携带同种单倍型，其长度为.1Kb的碱基对，COL5A1c.GA突变包含于其内。Sanger测序结果也证明该突变的链置换与最邻近的单倍型信息标签基因同相位。对于该区域毗邻基因克隆后发现相关限制酶可在突变位置处产生切割反应，进一步证明该基因单倍型的存在。在密歇根基因组倡议数据库中的频率为0.7%，而在G数据库中为0.4%。根据数据库结果，在四个先证者中均检测到这种单倍型的统计学概率是极小的。
图：基因连锁不平衡位点分析和单倍型分析
组织学检测
组织学评估表明，动脉瘤组织过度纤维化，而非动脉瘤组织则有中膜胶原增多且排列紊乱，平滑肌和弹力纤维也排列不规则。先证者与对照患者的动脉相比中膜纤维化程度更高，但是纤维化分布紊乱、动脉壁薄厚不均。黏蛋白细胞外基质累积表明病灶并未见到囊性中央型降解，同时动脉中未见平滑肌细胞坏死。以上结果表明，该疾病的初始阶段可能主要为纤维增生。免疫组化染色定量表明中膜COL5A1减少，但公认的TGF-beta通路激活相关标志物SMAD2磷酸化少量增加或不变。
图：先证者动脉中层的肌纤维发育不良的组织学表现
FMD队列中全外显子测序分析验证
最后研究者在mFMD患者队列中分析了COL5A1突变与疾病表型的关联。首先不考虑ACGM指南中的致病性突变，仅计算机推测的不良突变与人群中COL5A1突变与夹层的关系。接下来在分析COL5A1与特定血管病变表型的关联。名mFMD患者中，名有夹层或动脉瘤。外显子测序发现了33种突变，其中19个突变为患者携带的特殊突变，这19种突变中包括8个非同义突变和11个同义突变。所有非同义突变均为普通人群中的低频突变，其中7种突变经计算机预测为致病突变。在七个携带COL5A1不良突变的患者中，其他相关基因，如COL3A1,COL5A2,ACTA2,FBN1,TGFBR1/2,TGFB2/3,SMAD2/3/4/6,PRKG1,或LOX中并未检测到致病突变。7个COL5A1的突变位点中，有一种蛋白突变位于N端非螺旋区域，一种位于胶原蛋白中断域，三种位于三螺旋区域。其中p.(GlySer)突变对COL5A1的影响程度最大。考虑到临床预测标准后，仅p.(GlySer)突变符合致病性突变标准，其他突变从临床角度归类于意义未名的突变。7名COL5A1不良突变携带者均无结缔组织病病史及家族史。而在mFMD队列中，COL5A1的可能不良突变与动脉夹层显著相关，同时也表现出动脉床受累，内脏动脉和四肢末端动脉夹层。
表：COL5A1不良突变与mFMD患者临床特征的关联
总结：本研究发现COL5A1基因的c.GA,p.(GlySer)突变与DAAD疾病相关，且该突变位于原始单倍型中。计算机预测的COL5A1几种不良突变存在于2.7%的mFMD队列患者中，且这些突变与患者动脉夹层相关。因此，此类突变可能为致病突变或为疾病的影响因子。
文献来源：10./ATVBAHA..
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