引言
大家好，本周为大家带来的是一篇基因测序与基因编辑技术联用的文章，文章主要研究了Th17在不同刺激下不同的响应并发现、验证了几种TH17细胞的标志物。
Th17细胞是一类产生IL-17的Th细胞亚群，与许多炎症反应和自身免疫性疾病的发生和发展有关。IL-2、IL-23、IL-17A、IL-17RA等均是Th17细胞产生的重要炎症免疫因子，他们的抑制剂对类风湿关节炎，银屑病关节炎以及多发性硬化症等有效。但Th17细胞不同的细胞因子有其不同的信号调控机制。本文就脑脊髓炎的高峰期，从中枢神经和淋巴结中分离Th17细胞，利用RNA-seq分析探讨调节Th17细胞致病性和多样性的分子机制，同时利用基因编辑小鼠研究发现，Gpr65、Plzp、Toso和Cd51等4个基因与此类疾病的发生密切相关。
文章的重心在于运用了两种先进技术：单细胞测序和基因编辑。一直以来大家研究有一种类的细胞功能时往往遇到两难的矛盾：基因测序的通量高，但是难以有针对性地一一分析每个细胞，而流式细胞分选能够准确得到某一种细胞，但是通量较小而且只能检测少数几种指标，无法检测所有基因的表达情况且难以满足普通二代测序的样本需求，而今天的文章使用的是二者相互联用技术，究竟是如何实现的呢？下面我们就一探一二。
01
体内和体外分离的Th17单细胞的RNA-seq谱
Th17细胞作为免疫系统中介导真菌及其他病原体清除的重要细胞成分，能够释放细胞因子IL17来刺激免疫系统的正常免疫响应，维持黏膜屏障，同时与自身免疫疾病相关。下面我们就来看一下作者是如何展开研究。
作者首先通过髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）在小鼠体内进行自身免疫脑髓炎（EAE）的诱导收集淋巴结和中枢神经系统的细胞，同时在体外通过IL-1β+IL-6+IL-23β诱导致病组，通过TGF-β1+IL-6诱导非致病组，然后进行了单细胞测序，并对测序结果进行了一系列过滤，发现在相同条件下，个体细胞之间的表达存在显著差异（r=0.45-0.75图1D，1E）。测序结果如图1，作者还展示了流式细胞荧光原位杂交（FISH-Flow）结果，这里不再赘述。
图1.体内和体外Th17细胞的单细胞RNA-seq
A.实验设计；B.TGF-β1+IL-6体外诱导48小时两个大量群体重复之间转录物表达（FPKM+1，log10）；C.单细胞谱的‘平均值’和相应的大量群体对照；D.两个单细胞之间的对照；E.单个细胞与其匹配的群体对照之间以及单个细胞对之间的Pearson相关系数
不过小编在这有一个问题要考考大家：如何将体内的这些Th17细胞从大量细胞中筛选出来呢？答案其实很简单：作者利用了一种十分巧妙地工具鼠——TH17a-GFPKI小鼠。这种小鼠的TH17细胞会表达GFP蛋白，从而可以发光，进行流式分选。而这种鼠就来自百奥赛图，下图就是Ta的打靶方式。
图2.TH17-GFP+小鼠的打靶方式
02
单细胞测序功能注释显示Th17细胞的异质性状态
施加不同诱导后细胞个体之间产生了什么样的差异呢？作者带着问题对来自于体内实验的细胞进行了主成分分析（PCA）并按照主成分的空间功能注释进行分区得到了5种不同标记的细胞亚群，如Th17selfrenewing细胞亚群等，如图3A、C。
这样分析注释的好处是能够通过细胞亚群的特异性标记与PC分析之间进行评分，进而得到与每种PC相关的基因强烈富集的因子（Pearson相关性，FDR0.05；Fisher精确检验，p10-5），见图3E、F。
图3.Th17细胞跨越从LN到CNS的状态
A.PCA将CNS细胞与LN细胞分离；B.功能注释、特异性评分和皮尔森相关系数；C.从LN到CNS的五种Th17细胞状态在A图基础上按照特异性评分进行区分；D.区分每个亚群的示例基因；E、F.显著富集于PC2（E）或PC1（F）的转录因子（节点）节点的大小与倍数富集成比例并根据相应PC中编码基因的正负着色。
PC1对应从严重炎症情况（+）到记忆性T细胞（-）的主成分分析。PC2则按照细胞来源（中枢神经或淋巴结）划分，与细胞的状态相关，细胞周期活性低的细胞为正值，反之为负值（图3A）。文章还对不同细胞对应的特征标记进行了详细分析，本文不再赘述。这就体现了单细胞测序的重要性：可以按照不同的细胞特征将所有细胞分成不同的细胞亚群而拥有极大通量。
03
体外诱导细胞与体内致病细胞的相似性与区别
不过，体内分选得到的细胞相对于个体中数以亿计的细胞数量来说就如同沧海一粟，作者为了更深入的研究，于是进行了体外实验并与体内实验得到结果相比较。
图4.体外实验主成分分析
A.体外分化的Th17细胞的PCA图；B.图4C中Th17/Th1样记忆亚群的体外特征；C.Th17自我更新亚群的体外特征；D.致病性Th17细胞的体外特征；E.三种体外群体的Il10的表达水平（FPKM+1，log10）的CDF。
作者分析了在的个Th17细胞的单细胞RNA-seq谱：非致病条件（来自2个生物重复的个TGF-β1+IL-6诱导的未分选细胞和来自3个生物学重复的个TGF-β1+IL-6诱导的IL-17A/GFP+细胞）以及致病条件（来自2个生物重复的个Il-1β+IL-6+IL-23诱导的IL-17A/GFP+细胞）（图4A）。
通过图2B中的注释方法，作者发现体外分化的Th17细胞在致病性特征中变化很大且反应了其分化的条件，例如高致病性和致病条件下极化的IL-17A/GFP+处理细胞相关（图4D），非致病性条件的IL-17A/GFP+处理细胞与调节型细胞因子及其靶标的表达高度相关但在致病细胞中几乎检测不到（图4E）。刺激时间的变化与PC2相匹配，却不与PC1匹配，说明致病性由细胞状态控制而非细胞的分化程度控制。另外作者用图3C中的鉴定体内细胞亚群的方法对体外实验中免疫相关标志物评分（图4B、C），使得体外实验与体内实验相互关联起来。
04
通过炎症和调节模式之间的变化筛选新的调控因子
以上种种实验最终还是为了发现更多新的验证调节因子。于是作者带着这一目的分析了TGF-β1+IL-6诱导的的未分选细胞中每个基因的表达变异。图5A这种图或许大家比较陌生，大家可以认为是表达同一种基因的细胞按照表达量进行排序，由低到高向右延伸，横坐标代表对应细胞的基因表达丰度，越向右越强，图右侧标注了基因名称，并且基因顺序也是按照基因表达丰度排列，表达越高的越往上。即对应向左一行代表所有表达该基因的细胞群，颜色越深的区域，表示该区域表达该基因对应丰度的细胞数越多。因此对应图上，如果某基因对应一行只有一个较深区域，我们称之为单峰，即只有一群细胞表达该群细胞，在一个丰度；如果有两个较深的区域，即双峰，则有两群细胞表达该基因有两个不同的丰度。而出现双表达峰的基因其实是同时存在至少两种细胞能够表达该基因，其中一种细胞群某些基因表达量大一些，另一个细胞群这些基因表达量小一些。
结果表明90%细胞中有35%的基因只有一个表达峰，如管家基因、TH17特征细胞因子IL17和TH17分化必须的转录因子。另有20%细胞中高表达其余细胞中不表达或微量表达的双表达峰基因，包括炎症和调节细胞因子及其受体（例如，Il17a，Il10，Il21，Ccl20，Il24，Il27ra，图5A）。图5A这种图或许大家比较陌生，大家可以认为是表达同一种基因的细胞按照表达量进行排序，由低到高向图的右上延伸，而出现双表达峰的基因其实是同时存在至少两种细胞能够表达该基因，其中一种细胞群某些基因表达量大一些，另一个细胞群这些基因表达量小一些。这一点和下面的发现都说明了细胞基因的多样性。
另外除了表达TH17的主要转录因子，实验中还发现一些细胞能表达其他T细胞谱系的关键基因的转录物，这就暗示免疫基因调节的更大程度的多样性。
图5.与单个细胞中的促炎和调节基因共同变化的基因模式
A.基因的单细胞表达分布；B.与促炎和调节基因共变的模块；C.与促炎和调节基因共同变化的模块区分关键变化；D.关键模块基因的表达，每个小组显示（C）的PCA图
为了解释出现双峰的现象和基因调节的多样性，作者推断如果表达量的变化反映了不同的细胞状态，则整个基因模块应该在细胞间强烈地共变，于是作者分析了跨细胞的转录物之间的共变化的基因，并发现两个关键的转录模式：1.与已知的促炎Th17细胞因子共同变化，如Il17a和Ccl20；2.与已知的调节基因如Il10，Il24和Il9共同变化，图5B。
利用上述的两种模式对体外细胞进行注释（图4A、5C）发现炎症基因的共变模式相比调控基因的共变模式与炎症细胞相关性更高，图5C、D。继而通过对基因-炎症相关性结果排序就得到了新的调控因子，作者选择了相关性较高，且比较新颖的4个基因：Gpr65，Toso，Plzp和Cd5l进行了进一步的验证。
图6.验证GPR65，TOSO和PLZP的T细胞致病性调节作用
A、B.体外分化的GPR65-/-T细胞中产生IL17A的细胞的减少；C.回收实验显示GPR65?/?记忆(CD62L?CD44+CD4+)T细胞IL-17AandIFN-γ表达量下降；D.GPR65的缺失减少了诱导EAE的体内组织炎症和自身免疫疾病；E.GPR65，TOSO和PLZP缺失对转录的影响；F、G.在体外分化的TOSO-/-T细胞中产生IL17A的细胞的减少。H.回收实验显示TOSO-/-LN记忆T细胞减少IL-17A产生；I.回收实验显示TOSO-/-LN记忆T细胞减少IL-17A产生；J.离体96小时后的同窝对照和PLZP-/-小鼠的MOG35-55回收实验得到的细胞分泌IL-17A和IL-17F的定量检测。
05
GPR65可促进Th17细胞的致病性，对EAE至关重要
实验到了最终验证的一步，大家往往就放松了，但是作者丝毫没有懈怠，在多钟基因敲除鼠上进行了一系列的验证实验。下面我们就看一下文章是怎么做的呢？
GPR65是一种糖鞘脂受体，是与促炎基因共同变化的模块的成员（图5B），并且在我们的Th1样效应子/记忆细胞中高度表达（图3D）。与野生型相比Gpr65?/?小鼠未分化T细胞TGF-β1+IL-6或IL-1β+IL-6+IL-23诱导分化96h后IL17+细胞数量下降越40%，图6A。来自Gpr65-/-小鼠的记忆细胞在用IL-23再激活后也显示IL-17A+细胞减少~45％。敲除细胞中的致病性分化条件下，IL-17A（p0.01）和IL-17F（p10-4）分泌减少（图6B）。Gpr65-/-Th17细胞群的RNA-seq谱在非致病性和致病性条件下分化96小时，表明在Gpr65-/-细胞中最富集的上调基因是调节性Th17细胞的基因（p10-28，超几何测试，图6E）。
为了研究GPR65对自身免疫病的影响，作者利用野生型或Gpr65-/-CD4+T细胞重建了RAG-1-/-小鼠并诱导了EAE，结果发现Gpr65-/-的T细胞可以使小鼠避免EAE的发生（图6D）。
总结
文章展示了如何利用单细胞中基因表达量的变化来识别关键的调控因子和他们调控的机制，利用Th17细胞的细胞周期变化，研究了Th17细胞分化成效应/记忆细胞的机制，并筛选出了重要的相关基因。此外，本文的研究路径，展示了基因编辑技术与单细胞RNA测序技术的完美结合，完美的展示了先进的技术手段，如何成为科研发展的强大助力。
单细胞RNA测序技术，使得研究人员能够操纵并研究单个细胞内的具体基因，在更细微的水平上，实时，全面以及更准确地展示了解每个基因变化所带来的后续一系列细胞和基因水平的变化，在医学研究与遗传工程领域具有强大的应用潜力；而基因编辑技术由于CRISPR/cas9等技术的出现，更为基因表达及相关功能研究提供了强有力的工具，并已被广泛用于生命科学研究的各个领域，如本文中的Th17-EGFP小鼠，成为细胞分离分析的基础。
本文中用到的Th17-EGFP小鼠是由百奥赛图公司自主开发的，百奥赛图自主开发的基于C57BL/6小鼠胚胎干细胞的基因编辑系统具有独特的品系优势，基于CRISPR/Cas9技术自主研发的EGE系统将同源重组率提高近20倍，年改造基因改造大小鼠及细胞系超过种，欢迎随时垂询合作哦！
参考文献
GaublommeJT,YosefN,LeeY,etal.Single-cellgenomicsunveilscriticalregulatorsofTh17cellpathogenicity[J].Cell,,(6):-.
百奥赛图
百奥赛图基因生物技术有限公司（简称“百奥赛图”），公司总部现位于北京亦庄，在上海张江、江苏海门、美国波士顿设有分公司，同时在武汉、广州、成都等地设有办事处。
年在美国成立并成功运营，年北京百奥赛图总公司成立，并于年将总部迁址到北京亦庄经济技术开发区。
百奥赛图是一家以稳定、高效基因编辑技术平台为依托，以模式动物定制服务、重要模式动物开发与规模化繁殖与供应、体内药理药效评价服务、抗体药物研发外包服务为一体的高科技生物医药企业。
公司秉承以追求更好的人类健康为宗旨，旨在为新药研发领域提供高品质的产品与服务。
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