大量研究表明，有些基因在不同的组织或细胞中往往扮演着不同的功能，有时甚至是完全相反的作用，因此在研究基因功能时细胞特异性的基因表达调控尤为重要。腺相关病毒（Adeno-associatedvirus,AAV）作为高效、安全的基因递送载体，目前被广泛应用于体内目的基因的操作。那么在利用AAV调控体内基因表达时如何实现组织特异性呢？本文将详细介绍利用AAV实现组织特异性基因调控的常用策略。
原位注射AAV
首先，我们可以通过选择合适的注射方式来实现组织特异性基因调控，通常采用局部原位注射的方式，比如脑立体定位注射、肌肉定点注射、肝实质注射、心肌原位注射等，使得病毒只在局部范围内扩散，从而实现组织特异性的感染。这在神经、肌肉研究领域应用较多，比如图1中，作者通过脑立体定位技术将AAV-DHHC12-eGFP（Genechem）直接注射到大脑杏仁核，实现了在大脑杏仁核区域特异性的过表达DHHC12。
图1.脑立体定位注射AAV感染特定脑区
目前常见的通过定点注射的方式实现AAV区域特异性感染的方法及适用部位如表1所示。
表1.不同组织定点注射方法
AAV血清型
通过原位注射的方式只能保证注射区域特异性，而不能保证组织器官及细胞的特异性，这时我们可以利用组织特异性血清型来解决这一局限。AAV的血清型即抗血清类型，不同的AAV血清型具有不同的衣壳蛋白空间结构，而AAV感染细胞是通过其蛋白衣壳与细胞表面受体结合实现的（图2）。
图2.AAV感染细胞方式及结合受体
因此通过对AAV衣壳蛋白的改造，获得组织特异性血清型，使其识别特定的细胞表面受体，即可实现AAV特异性感染相应的细胞，从而实现特异性的基因调控。比如MartinTrepel等人发现BR1血清型能够特异性的感染小鼠大脑血管内皮细胞（图3）。
图3.尾静脉注射AAV-BR1-eGFP感染大脑血管内皮细胞
吉凯基因持续开发适用于不同组织或细胞的特异性血清型，目前已开发出多种特异性血清型（表2），目前客户使用效果反馈均比较好，如图4中案例所示，客户将AAVrh74-GFP通过尾静脉注射的方式打到小鼠体内，4周后检测全身组织中GFP表达水平，结果显示GFP集中高表达于肌肉组织中，显示吉凯的rh74血清型具有很好的肌肉特异性。
表2.吉凯基因组织特异性血清型列表
图4.尾静脉注射肌肉特异性血清型AAV后效果检测
组织特异性启动子
虽然特异性血清型理论上可以实现AAV的组织或细胞特异性感染，但由于细胞表面特异性受体分辨困难，目前可用的组织特异性血清型较少，尤其是细胞类型特异性的血清型极少。因此他们的应用范围较局限，而组织特异性启动子则很好的解决了以上的局限。
组织特异性启动子一般由特定细胞专一表达的基因启动子鉴定得来的，因此其容易筛选得到且潜在的组织特异性启动子种类较多，尤其是细胞特异性较特异性血清型更好。目前已报道的组织特异性启动子种类繁多，吉凯基因已累积为不同研究方向的老师开发出数十种针对不同组织、细胞的特异性启动子，具体如下：
AAV和工具小鼠联用
除了以上策略，基于Cre-loxp系统的的AAV+工具小鼠联用方案也被越来越多的应用。Cre-loxp系统是构建转基因小鼠最常见的系统，其来源于P1噬菌体，由cre和loxP两部分组成。Cre是一种重组酶，loxP是一段长度为34bp且具有方向性的序列。Cre能够识别loxP位点，当基因组内存在两个loxP位点时，Cre重组酶会识别这两个loxP位点并根据其相互位置及方向性而实现基因敲除、序列翻转以及基因转座。工作原理如下图所示：
图5.Cre-loxp系统工作原理图
目的基因的细胞特异性过表达/干扰
长期以来，人们构建了大量的组织或细胞特异性表达Cre的小鼠，如Nes-cre、PV-cre、GFAP-cre等，这为通过AAV和工具小鼠联用实现目的基因的细胞特异性表达奠定了基础。原理如图6.A所示，要求AAV必须要带有loxP位点，而工具小鼠中cre的表达必须为细胞特异性。MagdalenaGo便采用该策略构建了cre依赖的AAV（AAV-FLEx-Ngn2/Nur1），注射到星形胶质细胞特异性表达cre的小鼠（GFAP-Cremice）体内，从而实现了脑内星形胶质细胞特异性过表达Ngn2/Nur1（图6.B、C）。同样，如果将两对不同的loxP位点间序列改为靶基因的shRNA序列，则可以实现细胞特异性的干扰。
图6.Cre依赖的AAV设计策略及应用案例
目的基因细胞特异性的敲除
同样基于Cre-loxP系统，我们还可以结合AAV组织特异性启动子实现细胞特异性的目的基因敲除，原理如图7.A所示，要求工具小鼠中目的基因两侧带有loxP位点，AAV表达表达cre且用的是组织特异性启动子。CatherineM便利用该策略，给KORlox/lox小鼠注射AAV-TH-Cre，利用TH启动子特异性的在多巴胺能神经元中表达Cre重组酶，最终实现多巴胺能神经元中特异性敲除KOR（图7.B、C）。
图7.Loxp小鼠注射AAV实现细胞特异性的目的基因敲除
以上为目前AAV实现组织特异性调控目的基因的常用策略，对以上策略的优缺点总结如下：
在实际应用中，大家可以根据自己的特异性需求选择合适的实现方式。另外，为达到较好的特异性以及较高的表达效率，可以根据以上各方案的独特优势结合使用，比如通过特异性血清型+特异性启动子（ENT+ICAM2）组合实现血管内皮细胞特异性表达（图8）。
图8.小鼠尾静脉注射AAVENT-ICAM2-GFP特异性的感染血管内皮细胞
此外也可灵活结合注射方式+组织特异性启动子AAV+工具小鼠（脑立体定位注射+TH启动子+flox鼠）组合快速高效实现特异性基因调控。
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