分子生物学技术是基因诊断的主要技术。近年来随着分子生物学技术日新月异.以核酸分子杂交和聚合酶链反应(PCR)为核心发展起来了多种方法已被广泛用于基因诊断.如PCR单链构象多态性(singlestrandconformationpolymophism,SSCP)、限制性片段多态性(restrictionifragmentlengthpolymorphism,RFLP)、等位基因特异性寡核苷酸分析(llelespeifeoligonu-cleotide,ASO).基因芯片技术(genechip)、反转录PCR(reversetranseriptionPCR)、Southern印迹还杂交(Southernbloting)、Northern印迹杂交(Northemboting)、斑点杂交(dotbloting)和原位杂交(insiuhybridization.ISH)等。
(一)核酸分子杂交技术
核酸分子杂交是指两条互补单链核酸(DNA或RNA)在一定条件下按碱基互补原则退火形成双链的过程。它是研究核酸结构与功能的常用技术。
分子杂交的方法多种多样,其共同点是:
①应用了核酸序列的复性原理。
②都采用了标记探针。探针就是放射性核素或非放射性核素(如生物素或荧光染料等)标记的短片段特异DNA或RNA。常用的核酸分子杂交技术与评价见表4-10-。
(二)DNA测序
DNA测序即测定DNA一级结构,由于临床上进行各种突变分析的最终目的是获得突变信息，即确定具体的突变类型。DNA测序能直观地反映出DNA序列的变化,因此是诊断未知突变基因的最直接的方法,在遗传病和肿瘤的诊断、法医学的鉴定中具有非常重要的意义。DNA序列测定常用方法与评价见表4-10-3。
(三)聚合酶链反应
聚合酶链反应(PCR)是利用DNA聚合酶(如:TaqDNA)在体外催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外扩增技术。
PCR反应特异性强,灵敏度高.极微量的DNA即可作为扩增的模板得到大量的扩增片段。毛发、血痕甚至单个细胞的DNA即可通过PCR扩增进行检测。临床上常用于病原体DNA的检测、肿瘤残留细胞的检出.罪犯或个体遗传物质的鉴定以及遗传病的基因诊断等。应用RT-PCR还可对RNA病毒如丙型肝炎病毒和待检基因的表达量进行检测。
(四)连接酶链反应
连接酶链反应(LCR)是一种新的DNA体外扩增和检测技术,主要用于点突变的研究及靶基因的扩增，目前该方法已用于多个领域,如利用LCR法可以进行单碱基遗传病多态性的快速筛选、单碱基遗传病的产前诊断微生物亚种和亚型的鉴别多态性的分析、法医学中个体DNA的准确鉴别。由于LCR设计独特,在某些方面的优势(如检测点突变)尚不能为其他手段所取代，且LCR尚在不断完善和改进之中,故其作为一种有效的DNA扩增和检测技术具有很好的发展前景。
(五)单链构象多态性分析
单链构象多态性(SSCP)分析是-种分析突变基因的方法。目前,CP多与PCR技术联用(PCR-SSCP)检测基因突变,提高了基因突变检测的灵敏性,现已广泛用于遗传病及肿瘤基因的分析。
(六)限制性片段长度多态性分析
限制性片段长度多态性(RFLP)分析是限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术、探针---杂交技术的综合应用，多用于临床遗传性疾病的基因诊断。RFLP作为第一代遗传标记已经广泛地应用于遗传病的连锁分析。根据这些广泛存在的遗传标记,应用定位克隆策略已成功地确定了多种以孟德尔遗传方式为主的遗传病基因。同时,RFLP还可用于基因组同源性分析以及个体识别，后者在法医学中已成为常规手段和方法。
(七)单核苷酸多态性分析
单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP作为一种遗传标记的特性见表4-10-4。
(八)基因芯片技术
基因芯片通常指DNA芯片,其基本原理是将大量已知的寡核苷酸分子固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交.通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。基因芯片技术集成了探针固相原位合成技术.照相平板印刷技术高分子合成技术、精密控制技术和激光共聚焦显微技术,使基因芯片具有微型化.集约化和标准化的特点,实现了对靶基因的快速检测。
基因芯片在医学领域中的应用见表4-10-5。
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