手把手教你学会CRISPRCas9

CRISPR/Cas是进行基因编辑的强大工具，可以对基因进行定点的精确编辑。在向导RNA（guideRNA，gRNA）和Cas9蛋白的参与下，待编辑的细胞基因组DNA将被看作病毒或外源DNA，被精确剪切。

一、寻找目的基因的靶标

使用在线设计网站CRISPRdirect，如需直接复制网址，可在生物学霸后台对话框回复direct即可。

靶点挑选要点：

基因敲除靶点应设计在起始密码子附近（包括起始密码子）或者起始密码子下游的外显子范围内。

不同Cas9/gRNA靶点在基因敲除效率上有较大差异，因此同时设计构建2～3个靶点的基因敲除载体再从中选出敲减效果较佳的靶点。

N1-N20NGG靠近PAM的碱基对靶点的特异性很重要，前7～12个碱基的错配对Cas9切割效率影响较小。设计好的靶点序列应在基因库中进行BLAST检测。

Cas9Nicknase需要挑选成对的靶点。一般在正义链和反义链上分别挑选相距20～30bp的靶点配对。多对靶点的敲除效率常有较大差异。由于基因敲除实验时间长，在正式对目的细胞进行敲除前对靶点进行验证和挑选非常必要。

二、插入片段设计

插入寡核苷酸序列设计（必须PAGE纯化寡核苷酸）：

正向序列

5’ACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT3’

反向序列

3’TGTGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAATCTCGATCTTTATCGTTCAATTTTATTCCGATCAGGCAA5’

插入片段的合成

用水将寡核苷酸稀释为μM。按以下体系配制退火反应体系：

正义寡核苷酸（μM）5μl

反义寡核苷酸（μM）5μl

NaClmM（终浓度）

Tris‐ClpH7.mM（终浓度）

加水补足50μl

将配制好的退火反应缓冲液重复混合，短暂离心后放置PCR仪上，运行以下程序：90℃4min，70℃10min，55℃10min，40℃10min，25℃10min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在‐20℃长期保存。

三、pCas9/gRNA基因敲除载体的构建

用EcoRV酶切2μgpCas9/gRNA载体（inovogen）。通常情况下用大约20～30单位的酶大约3小时可以酶切完全。酶切后我们建议用琼脂糖凝胶回收线性化载体。将回收后的线性化载体定量，通常线性化载体的工作浓度为50～ng/μl。连接用水将退火后双链寡核苷酸(10μM)稀释倍备用。

连接反应体系：

T4DNA连接酶5U

EcoRV5U

线性化载体2μl

稀释倍后双链寡核苷酸1μl

10×连接酶Buffer1μl

50%PEGμl

加水补足10μl

反应条件：22℃30min，37℃15min。

注：

平末端连接效率较低，在连接体系中添加PEG可以提高连接效率。

在连接体系中添加EcoRV酶可以显著提高阳性率。

四、转化大肠杆菌感受态细胞及通过载体上的引物进行PCR鉴定阳性克隆

挑选阳性克隆进行测序验证,验证正确后,提取质粒进行转染试验,关于sgRNA是否有效。可以转染之后，直接提取DNA，通过测序验证，如果在靶标位点附近开始出现杂乱的多峰说明是sgRNA有效，如果没有则该sgRNA无效。