[实验原理]
将外源基因克隆到含有lac启动子的表达载体中，让其在大肠杆菌中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵子结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖），阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。表达蛋白可经SDS-PAGE检测或用Western-blotting检测。
[注意事项]
1、通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白.
2、外源基因不能带有间隔序列（内含子），因而必须用cDNA或化学合成的基因，不能用基因组DNA.
3、必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件调控外源基因的表达.
4、外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架.
5、利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止表达的外源基因产物对宿主的毒害。
[实验试剂]
1、LB培养基：配置每升培养基，应在mL去离子水中加入
胰蛋白胨10g
酵母提取物5g
氯化钠10g
溶解后，用1mol/LNaOH调节pH7.0，加入去离子水定容至1L，在℃高压蒸汽灭菌20mins。
2、50mg/mL卡那霉素：称5g卡那霉素，溶于10ml灭菌ddH2O中，于超净台上过滤除菌，-20℃贮存。（x）
3、1mol/LIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖）：将2gIPTG溶于10ml水中，用滤器过滤除菌，分装成1mL，-20℃贮存。（x）
[实验步骤]
1、含外源基因的表达菌株在LB培养基（含50μg/mLkana）中预培养过夜(注意取菌株要在超净台上操作，一定注意无菌)。
2、按1/50的比例稀释菌液，于r/min，培养3小时左右，使其OD值达到0.6。
3、加入IPTG，使其终浓度位0.5mmol/L。
4、继续培养。分别在0.5hr,1hr,1.5hr,2hr,3hr不同时间取样1ml，rpm离心5mins，收获菌体，弃上清。
5、SDS-PAGE检测外源蛋白的表达情况。
===============================SDS-PAGE凝胶电泳检测表达蛋白
[实验原理]组成蛋白质的氨基酸上带有可解离的（NH3＋）和羧基（COO－），是典型的两性电解质，在一定pH的溶液中会发生解离而带电，带电的性质和带电量的多少取决于蛋白质的性质及溶液的pH值和离子强度。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂过硫酸铵（简称Ap）和加速剂N,N,N’N’-四甲基乙二胺（简称TEMED）的作用下，聚合形成三维的网状结构。蛋白质在凝胶中受电场的作用而发生迁移，迁移的速率取决于蛋白质所带电荷的多少和蛋白质的大小和形状。在处理蛋白样品时加入的β-巯基乙醇在高温下可还原蛋白质的二硫键破坏其高级结构形成松散的肽链，肽链再与带负电荷的SDS（十二烷基磺酸钠）结合，形成棒状结构。蛋白样品经这样处理后，可以消除蛋白质间电荷和形状的差异，在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速率就只与其大小有关。通过与已知分子量蛋白质的电泳速率的比较可计算出其它蛋白质的分子量。[实验试剂]1、10％SDS(w/v)(ml)：10gSDS溶于ml去离子水中。2、1.5MTris-HCl,pH8.8(分离胶缓冲液)1.5mol/L×.1g/mol×0.1L=18.g用1NHCl将pH调节到8.8。3、0.5MTris-HCl,pH6.8（浓缩胶缓冲液）0.5mol/L×.1g/mol×0.05L=3.g用1NHCl将pH调节到6.8。4、1mol/LHCl5、凝胶储备液(30%Acr-0.8%Bis)30gAcr溶于50－60ml去离子水，再加入0.8gBis，搅拌溶解；加水定容至ml。过滤后，储存于棕色瓶中。6、10％(w/v)过硫酸铵50mg溶于μl去离子水（现用现配）。7、2×上样缓冲液0.5mol/LTris-ClpH6.82mL甘油2mL
20％(W/V)SDS2mL
β-巯基乙醇1mL
0.1%溴酚蓝0.5mL双蒸水2.5mL室温存放备用。8、电泳缓冲液（1×新鲜配制）0.mmol/LTris-HCl0.mol/L×.1g/mol×1L=3gTris0.mmol/L甘氨酸0.mol/L×75.1g/mol×1L=14.4g0.1%(w/v)SDS0.1g÷ml×ml=1g溶于ml去离子水中。9、染色液0.2g考马斯亮兰R-(w/v)84mL95％乙醇(v/v)20mL冰醋酸(v/v)用去离子水定容至ml，然后过滤备用。10、脱色液：医用酒精：冰醋酸：水=4.5:0.5:5(V：V：V)11、保存液：7％冰醋酸12、悬浮缓冲液mMTris-HClpH8.0[实验步骤]1、凝胶制备
(1)先制分离胶。将快速混匀后立即将分离胶注入玻板，用1cm去离子水封口，约30-40min后凝聚。
(2)将胶面的水吸干。
(3)配制浓缩胶。混匀后加到夹缝中，插入梳子。胶凝固后小心拔出梳子，用uL微量注射器抽取电极缓冲液冲洗拔出后的加样凹槽底部，清除未凝的丙烯酰胺。
凝聚组份
12％分离胶（10ml）
4％浓缩胶（4ml）
去离子水(ml)
分离胶缓冲液(ml)
浓缩胶缓冲液(ml)
凝胶储备液(ml)
10％SDS(μl)
10%过硫酸铵(μl)
TEMED(μl)
3.4
2.5
---
4.0
20
5
2.4
---
1.0
0.53
40
10
5
2、样品制备：用30μL悬浮缓冲液悬浮细胞加入30μL2×SDS上样缓冲液于℃水浴5分钟。取出待用。3、凝胶电泳将玻璃板凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液。加样：分别在不同的加样孔中加入标准蛋白和已经处理好的蛋白样品10uL。
电泳：V恒压33min。4、染色、脱色电泳完毕，将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上剥下胶。移去浓缩胶，将分离胶用考马斯亮蓝染色液染色，在摇床上染色2-3小时；之后，在脱色液中脱色4-5小时。
[结果分析]
图2-11-1SDS-PAGE电泳
M:蛋白质标准分子量;1.诱导前全菌蛋白图；2-6.不同时间诱导后全菌蛋白图.
[注意事项]1、Acr和Bis在没有聚合时是一种神经毒剂，可在人体内积累，在使用时应注意安全。
2、Acr和Bis在光下和碱性条件下可分解为丙烯酸和双丙烯酸，因而其溶液需3、在4℃下避光保存，保存期不要超过3-4星期。
4、蛋白样品在加热前不可放室温下，煮过的样品可在室温下放置，但每次使用之前需再煮一次。
5、电泳完毕，应先关电源，再取下电泳槽的盖子。在电泳时，要有阴性对照。
6、由于SDS-PAGE电泳的特点，目的外源基因凝胶中的谱带可能会上下偏移。
[实验安排]
第一天：配制试剂和培养基，高压灭菌；挑取单菌落过夜预培养。
第二天：诱导表达。
第三天：SDS-PAGE电泳。赞赏
